鲁芸芸　潘跃龙　曹骐　邓先宽　张劲松

【摘 要】本文使用经典的稀释涂布平板培养法建立检测淤泥和浓缩液等放射性样品中是否有微生物生长的方法，主要检测其中的细菌和真菌总数。实验结果表明，淤泥样品中细菌总数范围为105～106个/g，真菌总数范围为10～103个/g；浓缩液样品中均未检出细菌和真菌。该方法可用于快速检测放射性样品中的细菌和真菌总数，对放射性废物后处理与处置方法的生物评价具有重要的参考意义。

【关键词】细菌总数；真菌总数；平板涂布；生化培养

【Abstract】This paper uses the classic dilution coating and plating culture to establish the detection method of whether microbes grew in the radioactive samples， such as sludge and concentrate， etc. and mainly detect the total number of bacteria and fungus. The experimental results show that， in sludge samples， the total number of bacteria range from 105 to 106 cfu/g， and the total number of fungus range from 10 to 103 cfu/g； In concentrate samples， no detection of bacteria and fungus. This method can be used for rapid detection of the total number of bacteria and fungus in radioactive samples， it has important reference value to biological assessment of radioactive waste treatment and disposal methods.

【Key words】Total number of bacteria； Total number of fungus； Dilution coating； Plating culture

0 前言

微生物中存在着一类腐蚀性微生物，其生长和活动严重影响着废弃物的长期处置。美国爱达荷国家工程与环境实验室（INEL）对商用低放废物处置场中有代表性的土壤进行取样分析中发现，环境中普遍存在着氧化硫硫杆菌，这类自养菌在强碱性水泥固化废物体表面上能形成生物膜，在代谢活动中不断释放硫酸，影响固化体性能。M.A.Idachaba等检验得出，微生物在接近或在废物固化体表面的微环境活动时，能不断产生溶解性有机或无机酸，从而形成微量酸的点源并由此引起固化体基质溶解和污染物的释放。可见，废物固化体在考察其包容能力的同时还要考察其承受微生物降解的能力。

微生物在冷样品中的检验方法已日趋成熟，而在放射性领域的检测方法与研究尚未见报道。广核大亚湾核电站的放射性废水回收系统（SRE）和核取样系统（RPE）中沉积了大量带放射性的淤泥、以及废液处理系统（TUE）中带放射性的浓缩液，从安全、环保的角度出发，采用水泥固化技术处理这些放射性废物。为保证水泥固化体的稳定性，需检验其中的微生物，而细菌总数和真菌总数是衡量样品中是否有微生物存在的一项重要指标。微生物个体极小，肉眼无法观察，需经过单细胞的生长和繁殖，才便于观察。因此，本文拟使用经典的稀释涂布平板法（dilution plating procedure）检测来自广核放射性淤泥和浓缩液样品中细菌和真菌的菌落总数。该方法具有简便、快速、均匀以及便于计数的特点。

1 实验内容

1.1 样品的预处理

由于放射性样品较多，剂量较大，导致实验工作量大，而实验场地有限，故采取分批取样的方式。取样工具均用灭菌处理过的试管、不锈钢勺或移液管等，操作人员均戴上一次性医用无菌手套和口罩，避免引入杂菌污染。分批采集新鲜的淤泥样品适量（约1g）、浓缩液样品1mL分别于6个灭菌的试管中，制作均匀的样品悬液作为供试液：即分别加入无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至10mL，塞上灭菌塞子，在漩涡混合器上振荡约10min，使淤泥均匀地分散在溶液中而成。分析样品的详细信息见表1：

1.2 培养基的制作

筛选适宜细菌生长的营养琼脂培养基，其配方为：蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，NaCl 5.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL；筛选适宜各类真菌生长的改良马丁氏琼脂培养基，其配方为：蛋白胨5.0g，葡萄糖10.0g，磷酸二氢钾 1.0g，硫酸镁0.5g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，1%孟加拉红水溶液3.3mL。培养基经高压蒸汽灭菌后，加入1%链霉素液3mL（30μg/mL）。

细菌培养基和真菌固体培养基经高压蒸汽灭菌20min后，冷却至50℃左右倒入培养皿，静置冷却成为平板，备用。

1.3 十倍稀释法操作

将1.1步骤中的供试液静置10min自然沉降，吸取1mL上清液至另一支无菌试管，并加无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至10mL，混匀，即稀释10-1倍。如此连续稀释，制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等系列稀释菌液。

1.4 平板涂布法操作

按浓度从低到高进行涂布，分别吸取10-6的稀释菌液0.2mL，加入到已编号的三个营养琼脂平板和三个马丁氏琼脂平板上，用L型玻棒均匀涂布，静置5～10min使稀释菌液充分被平板吸收。然后依次进行10-5、10-4、10-3、10-2、10-1的涂布实验。

阴性对照实验：细菌和真菌实验分别做2个平行空白对照，吸取0.2mL无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至平板，用L型玻棒涂布均匀，同理静置。

1.5 恒温生化培养

将1.4步骤涂布完成的营养琼脂固体平板倒置于恒温细菌培养箱，在32℃条件下培养3天；同理将改良马丁琼脂固体平板倒置于恒温真菌培养箱，在25℃条件下培养5天。

1.6 观察及计数

待平板上菌落长出后，先用肉眼观察细菌和真菌菌落形态，拍照。然后点数菌落数，然后持放大镜检查有无遗漏，各平板计数后，求出同一稀释级各平板生长的平均菌落数。

1.7 计算方法

2 结果和讨论

2.1 稀释涂布实验结果

2.1.1 细菌菌落的形态观察

1）细菌稀释度平行实验

各样品的细菌菌落生长状态如图1所示：阴性空白对照的两个平板均未有杂菌生长，故营养琼脂平板正常，未被杂菌污染。SRE201BA、SRE001BA、SRE002BA和RPE003PS在低稀释级涂布的3个平行平板生长的菌落较多，但细菌总数随着稀释级的增高而相应减少，在高稀释级均无细菌生长。9TUE001EU和L9TUE001EU中各平行稀释级中均无细菌生长。

2）细菌菌落的形态特征（图2）

从图2可知，细菌菌落形态各异，并带有不同的颜色，说明淤泥中有多种类的细菌生存，并产生相应的抗异性及适应了淤泥的放射性环境。细菌菌落的形状有圆形、不规则和点状等；细菌的高度从侧面观察为隆起、突起以及平面状；细菌菌落的边缘形状为波形、丝状、卷曲状、光滑。SRE001BA和SRE002BA的细菌菌落相似，菌落较大，菌落颜色有淡红色、黄色、淡黄色和白色，而RPE003PS的菌落较小，菌落颜色有淡红色、黄色和淡黄色。

2.1.2 真菌菌落的形态观察

1）真菌稀释度平行实验

在稀释涂布实验中，6个样品菌悬液的每个稀释度作3个平行样，并作两个阴性空白对照。在25℃恒温条件下培养5天后，真菌菌落生长状态如图3所示：

从图3可以观察到，阴性空白对照的两个平板均未有杂菌生长，故改良马丁氏琼脂平板正常，未被杂菌污染。各样品中检出的真菌数量均较少，其中SRE001BA和SRE002BA平板生长的菌落稍微比SRE201BA和RPE003PS多， 在稀释级10-2以后均无真菌生长。9TUE001EU和L9TUE001EU中各平行稀释级中均无真菌生长。

2）真菌菌落的特征（图4）

从图4可以看出，样品中的真菌菌落形态各异，基本以霉菌为主，有菌落中心带有粉色、墨绿色，浅绿色等不同的颜色，说明样品中也有少量种类不一的真菌存在，并产生相应的抗异性并适应了淤泥和蒸残液的放射性环境。真菌菌落的形状有绒毛状、规则发射叶状等；真菌的高度从侧面观察为隆起、突起和褶皱状；真菌菌落的边缘形状有波形、丝状。

2.2 稀释度选择及菌落报告方式

根据6个样品的细菌和真菌的稀释度平行实验培养生长出的菌落，选择细菌平均菌落数在30～300，真菌平均菌落数在30～100之间进行计数，计数结果如表2、表3所示：

从表2可知，淤泥样品中均含有大量的细菌，SRE001BA、SRE002BA和RPE003PS的细菌总数均在106个/g的数量级范围内。9TUE001EU和L9TUE001EU均未检出细菌；从表3可知，淤泥样品中真菌含量较少，SRE201BA、SRE001BA和SRE002BA的真菌总数均在103的数量级范围内。9TUE001EU和L9TUE001EU均未检出真菌。

3 结论

采用经典的稀释涂布平板培养法检测来自于广核淤泥和浓缩液等6个放射性样品中是否有微生物生长，主要以考察其中的细菌和真菌总数的方式进行验证。结果表明，淤泥样品中有大量的细菌和少量真菌存在，而浓缩液样品中均无细菌和真菌生存。

该方法可用于快速检测放射性样品中的细菌和真菌总数，为后期在放射性废物的固化处理中验证微生物活动对废物固化体完整性的影响提供实质性的参考依据，对放射性废物后处理与处置方法的生物评价具有重要的意义。

【参考文献】

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[责任编辑：杨玉洁]