马 骏，罗华明，张玲茜

(1.台州市海洋环境监测中心,浙江台州318000; 2.台州市水产质量检测中心,浙江台州318000)



液相色谱串联质谱测定水产品中硝基呋喃类代谢物残留

马 骏1，2，罗华明2，张玲茜1

(1.台州市海洋环境监测中心,浙江台州318000; 2.台州市水产质量检测中心,浙江台州318000)

摘 要：建立起一种用于测定水产品中呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃它酮等代谢物残留的高效液相色谱串联质谱分析方法。样品经乙腈提取,以二甲亚矾为衍生试剂,利用液相色谱串联质谱进行分析测定。以乙腈和0.2%乙酸水溶液作为流动相,梯度洗脱,电喷雾正离子多反应模式监测。在0.5～10.0 μg·kg-1时,4种硝基呋喃类代谢物呈良好的线性关系,且回归系数都在0.999以上,回收率为89.05%～95.51%,相对标准偏差为4.09%～5.05%。该方法灵敏、准确、高效,适用于水产品中硝基呋喃代谢物残留的测定。

关键词：硝基呋喃代谢物;液相色谱串联质谱;仪器分析

文献著录格式:马骏,罗华明,张玲茜.液相色谱串联质谱测定水产品中硝基呋喃类代谢物残留[J].浙江农业科学,2016,57 (4):558-562,610.

硝基呋喃类药物(nitrofurans)是人工合成的一类具有5-硝基呋喃基本结构的广谱抗菌药物,主要包括呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃它酮。呋喃唑酮具有广谱抗菌活性,有单胺氧化酶抑制作用,可抑制苯丙胺等药物的代谢而导致血压升高,另外也可抑制乙醛脱氢酶的活性[1];呋喃妥因主要用于治疗尿道感染,对大多数革兰氏阳性和阴性菌,如大肠杆菌、腐生链球菌、肠球菌及变形杆菌,有杀灭或抑制作用,在尿道中具有较强的抗菌作用[2];呋喃西林主要供局部应用或创伤感染时外用消毒。

呋喃它酮具有强致癌性,呋喃唑酮具中等强度致癌性。1976年,美国食品和药物管理局(FDA)指出:呋喃唑酮在动物体内降解非常迅速,可能具有致癌性[3]。Ali[4]通过对小白鼠和大白鼠的毒性研究表明,呋喃唑酮可以诱发乳腺癌和支气管癌,并且存在剂量反应关系;高剂量饲喂食用鱼和观赏鱼,可诱导鱼的肝脏发生肿瘤[5];且能影响细胞的染色体交换和对损伤的修复,可使DNA单链发生内部交链从而抑制DNA的合成,并且能够抑制RNA和蛋白质的合成[6]。

呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因等硝基呋喃类药物在体内代谢产物分别为3-氨基-2-唑烷基酮(简称AOZ,下同)、5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮(简称AMOZ,下同)、氨基脲(简称SEM,下同)、1-氨基-2-内酰脲(简称AHD,下同)。呋喃唑酮进入体内后,代谢非常迅速。鱼体内的半衰期仅0.27 h[7]。由于硝基呋喃类代谢物残留具有较低的质量和微弱的紫外吸收特性,致使分析检测变得困难。为了诱导分子紫外吸收,通常将代谢物用2-硝基苯甲醛(2-nitrobenzaldehyde,2-NBA)衍生,以使其代谢物能被液相色谱紫外检测器检测到。硝基呋喃代谢产物(AOZ,AMOZ,SEM,AHD)可在酸性条件下被水解,可同时用2-NBA衍生化。目前,对其代谢物残留进行检测主要有液相色谱-质谱(LC-MS)或液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)方法。本研究基于液相色谱-串联质谱的高灵敏度,对水产品中硝基呋喃类代谢物残留量及其不确定度评定进行探讨。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1主要仪器

API300串联四极杆质谱仪(美国ABI公司),配有电喷雾离子源(ESI源)和Agilent 1100 series高效液相色谱仪; Heraeus Biofuge Stratos台式离心机; WH-866旋涡混合器; pH计;恒温水浴振荡器;电子天平;匀浆机;超纯水器; OA-SYSTM氮吹仪; ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(2.1 mm× 150 mm×5 μm);

1.1.2试剂

标准品有呋喃唑酮代谢物AOZ、呋喃它酮代谢物AMOZ、呋喃西林代谢物SEM、呋喃妥因代谢物AHD,均由德国Dr.E公司提供。

衍生化试剂。称取200 mg 2-NBA (Sigma公司,德国)溶于12.5 mL二甲亚矾中,现用现配。

乙腈、甲醇、乙酸乙酯均为色谱级。

定容液。0.2%乙酸∶乙腈15∶85 (V/V),盐酸溶液(0.2 mol·L-1),氢氧化钠溶液(0.1,1 mol·L-1)。

1.1.3对虾

对虾样品均由台州市水产质量检测中心提供。

1.2方法

1.2.1标准溶液的配制

标准储备液(0.5 mg·mL-1)配制。精密称取硝基呋喃类代谢物标准品AOZ,AMOZ,SEM,AHD,用甲醇定容,4℃以下保存。

标准工作溶液的配制。将标准储备液用甲醇∶水按1∶1的体积比稀释至相应浓度,4℃以下保存。

1.2.2样品及标准品处理

参照GB/T 21311—2007进行操作。称取2 g(精确至0.01 g)匀浆后的样品于50 mL离心管中,加入0.2 mol·L-1盐酸溶液20 mL和衍生化试剂1.0 mL,漩涡振荡2 min,之后置于恒温水浴振荡器上37℃避光振荡水解过夜(约16 h)。取出冷却后,加入0.5 mol·L-1磷酸氢二钠溶液1 mL,然后用1 mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH值至7.0～ 7.5。加入乙酸乙酯10 mL,振摇1 min,4 000 r· min-1离心10 min,收集乙酸乙酯层,再用乙酸乙酯10 mL重复提取1次,合并乙酸乙酯层,50℃氮气吹干,残留物用1 mL含0.2%乙酸的15%乙腈水溶液超声溶解,经0.22 μm微孔滤膜过滤后,取40 μL进样检测。

1.3HPLC-MS/MS检测

1.3.1HPLC条件

色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(2.1 mm×150 mm×5 μm);柱温为35℃;梯度洗脱程序见表1。

表1　流动相梯度洗脱程序

1.3.2质谱条件

离子源为电喷雾离子源(ESI);扫描方式为正离子扫描;检测方式为多反应监测(MRM);电喷雾电压(IS)为5 500 V;雾化气(NEB)参数为10;气帘气( CUR )参数为11;碰撞气(CAD)参数为6;辅助气(AUX)流速为8 L· min-1;辅助气温度(TEM)为475℃;去簇电压(DP)为50 V;聚焦电压(FP)为350 V;碰撞室出口电压(CXP)为13.0 V; Q1,Q3均为单位分辨率(UNIT)。定性离子对、定量离子对、采集时间(Dwell)及碰撞能量(CE)具体见表2。

表2　硝基呋喃类代谢物检测的部分质谱参数

2　结果与分析

2.1测定方法的线性关系

采用内标法对定量离子对进行定量计算,以待测物浓度与内标物浓度的比值为横坐标,以待测物峰面积与内标物峰面积的比值为纵坐标,建立线性关系(图1)。

在待测物浓度0.5～10.0 μg·kg-1的范围内,4种硝基呋喃类代谢物均呈良好的线性关系,回归系数都在0.999以上。

图1　硝基呋喃类代谢物的线性关系

2.2样品测定

按照上述方法和条件对样品进行检测,得出的质谱图见图2。

2.3系统精密度

用所建立的检测方法测定加标的同一对虾样品,测定结果见表3。

表3　系统精密度测定结果

2.4回收率

以对虾空白样品为试验材料,并向空白样品中分别添加浓度为0.5,1.0和5.0 μg·kg-1的标准品,然后按照上述方法进行水解衍生,提取净化后用于测定,以内标法计算来验证方法的回收率。结果见表4。

2.5质谱条件的优化

根据硝基呋喃类药物分子的结构特征,选择ESI ( + )作为电离模式,采用半自动进样方式,分别用高浓度(1.0 mg·mL-1)的AMOZ,SEM,AHD和AOZ及同位素内标物AOZ-D4,AMOZ-D5,AHD-D3和SCA-13C-15N2的标准溶液在酸性条件下用2-硝基苯甲醛衍生化,然后调节pH值至近7.4,再用乙酸乙酯萃取2次,氮气吹干,然后用甲醇/水溶液(1∶1,V/V)溶解残留物。接着以流动注射的方式在正离子模式下对4种代谢物和4种内标物的衍生化产物进行母离子全扫描,确定AMOZ,SEM,AHD,AOZ,AOZ-D4,AMOZ-D5,AHD-D3和SCA-13C-15N2的m +1离子分别为m/z 335,m/z 209,m/z 249,m/z 236,m/z 240,m/z 340,m/z 252和m/z 212。然后分别以所得的m/z数为母离子,对其子离子进行全扫描,结果如图3所示,并从中选取2个子离子。之后,多反应监测(MRM)优化去簇电压(DP)、聚焦电压(FP)、碰撞气(CAD)、碰撞能量(CE)等质谱参数,结果显示,以DP和CE对离子对的丰度影响最大(图4)。

图2　硝基呋喃类代谢物及内标物的提取离子色谱图

表4　回收率测定结果

接着用FIA方式继续优化雾化气(NEB)、气帘气(CUR)、电喷雾电压(IS)、辅助气温度(TEM)等参数。

图3　子离子的扫描结果

图4　不同质谱条件对离子对丰度的影响

3　小结

本文基于液相色谱-串联质谱技术对水产品中硝基呋喃类代谢物残留的测定方法进行研究,建立起一套基于高效液相色谱-串联质谱可同时测定水产品中4种硝基呋喃类代谢物(AOZ,AMOZ,SEM,AHD)的方法。该方法在0.5～10.0 μg· kg-1线性良好。用内标法定量,样品回收率在80%～110%,符合出口日本、欧盟等国家的最低残留检测限量要求(1 μg·kg-1)。

参考文献:

[1]TIMPERIO A M,KUIPER H A,ZOLLA L.Identification of a furazolidone metabolite responsible for the inhibition of amino oxidases[J].Xenobiotica,2003,33 (2):153-167.

[2]JOHNSON J R,BERGGREN T,CONWAY A J.Activity of nitrofurazone matrix urinary catheter against catheter-associated uropathogens[J].Antimicrobial Agents & Chemotherapy,1993,37 (9):2033-2036.

[3]史志城.动物毒理学[M].北京:中国农业出版社,2001:516-517.

[4]ALI B H.Some pharmacological and toxicological properties of furazolidone[J].Veterinary Research Communications,1983,6 (1):1-11.

[5]AURO A,SUMANO H L,BARRAGAN A.Evaluation of the carcinogenic effects of furazolidone and its metabolites in two fish species[J].Pharmacogenomics Journal,2004,4 (1):24-28.

[6]CHATTERJEE S N,BANERJEE S K,PAL A K,et al.DNA damage,prophage induction and mutation by furazolidone[J].Chemico-biological Interactions,1983,45 (3):315-326.

[7]PLAKAS S M,SAID K R E,STEHLY G R.Furazolidone disposition after intravascular and oral dosing in the channel catfish[J].Xenobiotica,1994,24 (11):1095-1105.

(责任编辑：高 峻)

中图分类号：S668.4

文献标志码：A

文章编号：0528-9017(2016)04-0558-05

DOI10.16178/j.issn.0528-9017.20160433

收稿日期:2015-12-31

作者简介:马 骏(1982—),男,浙江临海人,本科,工程师,主要从事水产品质量与海洋环境监测研究工作,E-mail:tzhyjmajun009@163.com。