王建昌，　王金凤，　李　静，　孙晓霞，　陈瑞春（河北省出入境检验检疫局检验检疫技术中心，河北石家庄050051）



基于内参的志贺氏菌实时荧光定量PCR快速检测

王建昌，王金凤，李静，孙晓霞，陈瑞春*
（河北省出入境检验检疫局检验检疫技术中心，河北石家庄050051）

摘要：根据Genbank已公布的志贺氏菌基因组序列，筛选特异性靶基因ipaH，设计特异性引物和探针，优化反应体系，并在体系中加入内参（IAC），通过标记不同荧光基团的TaqMan探针来监测IAC，进而实时监控整个PCR反应过程。按照人工污染样品，以评价所建立反应体系的性能。以志贺氏菌基因组DNA为模板，最低检测限为1 pg/uL；以10倍梯度稀释的菌液用水煮法提取DNA为模板，最低检测限为9×103CFU/mL；以含有ipaH的质粒为模板，最低检测限可以达到103考贝/uL；建立ipaH和ipaH-IAC标准曲线，Ct值与模板拷贝数均呈良好的线性关系（R2=0.999）；人工污染初始菌量为10 CFU/25 g羊肉时，志贺氏菌在增菌6 h后即可检出（水洗加试剂盒法）。作者建立的ipaH-IAC实时荧光定量PCR方法，既能有效检测食品中志贺氏菌，又能实时监测PCR反应过程，有效防止"假阴性"的发生，进一步保证了结果的可靠性，有利于实现样品中志贺氏菌实时荧光定量PCR检测方法的标准化。

关键词：志贺氏菌；ipaH；实时荧光定量PCR；内参

志贺氏菌（Shigella）是引起人类细菌性痢疾的主要病原菌，通称痢疾杆菌，为兼性厌氧菌，按照抗原结构和生化反应的不同分为痢疾（A群）、福氏（B群）、鲍氏（C群）和宋内氏（D群）志贺氏菌。该菌可引起食源性暴发，临床表现通常为带血腹泻，在发达国家志贺氏菌感染主要为D群，而在我国流行菌株则以B群为主[1-4]。志贺氏菌引起痢疾的传染源主要为病人和带菌者，主要是通过污染了志贺氏菌的食物、饮水等经口感染，具有十分重要的公共卫生学意义[5]。全世界每年志贺氏菌污染食品引起的发病数超过2亿，其中死亡人数达65万[6]。据报道，在美国志贺氏菌是继1997年沙门氏菌和空肠弯曲杆菌之后的引起食源性疾病的主要病因[7]，尤其儿童易引起感染性腹泻[8-9]。

目前志贺氏菌常规检测方法是生化检测方法GB 4789.5-2012，首先对样品进行增菌，分离培养，通过生化反应、溶血试验以及协同溶血试验对可以菌落进行鉴定分析，如果确定为志贺氏菌则要进行进一步血清型试验。该检验步骤繁琐、耗时长、准确性低，且一次检测的样品数较少。免疫学方法检测相对常规方法具有灵敏度提高，操作简便。钟青萍等[10]建立了双抗夹心ELISA法检测志贺氏菌，对37℃、1 h纯培养的菌液检出限为105CFU/mL，但ELISA由于实验影响因素较多，会引起假阳性，需要其他方法辅助检测。分子检测方法的建立，给致病菌的检测提供了一个快捷、高效、灵敏的检测平台。Kenia[11]建立了以志贺氏菌ipaH基因为检测靶点的具有扩增内参的多重PCR方法，该检测方法的检测限为104 CFU/mL。Barletta[12]以志贺氏菌ipaH、沙门氏菌invA、空肠弯曲菌16S rRNA基因建立多重RT-PCR方法，检测限为103CFU/g，而在临床粪便样品中的检测线为104CFU/g。上述PCR方法多数仅对纯培养的志贺氏菌进行了分析，而未对增菌后的样品提取核酸进行研究评估。在PCR检测方法的实际应用中，部分样品基质复杂，存在大量未知的复杂成分，可能会存在影响PCR扩增的物质，同时核酸提取过程中残留的物质也可能导致PCR扩增的抑制，从而出现“假阴性”结果或定量值较低。

作者所建立的志贺氏菌检测方法是一种基于内参（Internal Amplification Control，IAC）的实时荧光定量PCR方法，在反应体系中添加IAC以对整个反应过程进行实时监测，从而有效的防止“假阴性”结果的产生，并通过水煮法和商业化试剂盒法对增菌后样品提取核酸进行靶基因检测，均取得了良好的检测结果，同时有效推动了志贺氏菌实时荧光定量PCR检测方法的标准化。

1　材料与方法

1.1实验用菌株

实验所用菌株见表1。

1.2主要试剂和仪器

木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂，志贺氏菌增菌肉汤：北京陆桥公司产品；基因组DNA提取试剂盒：2×Taq PCR Master Mix，天根生化科技公司产品；Premix Ex Taq，pMD○R 19 -T Simple Vector：TaKaRa公司产品；核酸蛋白分析仪：Eppendorf公司产品；PCR仪：TECHNE公司产品；实时荧光定量PCR仪：ABI公司产品。

1.3引物和探针的设计

通过查找相关文献[9，13]，选择ipaH作为志贺氏菌检测靶基因。从GeneBank中下载ipaH靶序列，应用DNAstar软件对下载的多个靶序列进行比对，查找保守序列。用Primer Express 3.0软件设计引物和探针，用BLAST工具进行比对，分析其特异性，将探针的5‘端标记FAM，3’端标记Eclipse。引物和探针序列详见表2。

表1　实验所用菌株Table 1 Strains in this study

表2　实验中所用引物探针序列信息Table 2 Information about the primers and probes

1.4扩增内参的构建

采用复合引物法[14]构建扩增内参（IAC），选择乳仓鼠肾细胞（BHK-21）的Nmi基因作为内参基因，使用Primer Express 3.0软件设计扩增内参引物和探针（序列见表2），将内参探针标记CY5荧光基团，在内参引物5’末端分别连接上ipaH检测引物，形成一对内参引物和目标引物的长引物，经长引物扩增后得到扩增内参。内参片段连接载体pMD19-T，转化感受态细胞，测序验证；提取质粒，测定浓度，-20℃保存备用，菌液于甘油中-80℃保存。

2　方法

2.1志贺氏菌基因组DNA的提取

本研究中志贺氏菌（福氏志贺氏菌CICC21678，下同）基因组DNA的提取分别采用以下2种方法进行。

2.1.1水煮法将1 mL菌液转入1.5 mL Eppendorf离心管中5 000～8 000 r/min离心5 min，弃上清收集菌体。加入200 μL无菌去离子水，振荡混匀，100℃水浴10 min后，12 000 r/min离心10 min，上清作为DNA模板-20℃保存备用。

2.1.2水洗法加天根提取试剂盒法取增菌液样品1 mL，放入1.5 mL离心管中，800 r/min离心5 min或静置5～10 min，沉淀培养物中的食品残渣。取上清液，在8 000 r/min离心5 min，收集菌体。倒去上清液后，用无菌双蒸水重悬浮菌体，离心洗涤3次，然后将沉淀用试剂盒进行DNA提取。

2.2志贺氏菌ipaH实时荧光定量PCR中引物和探针浓度的优化

以志贺氏菌基因组DNA作为模板，取不同浓度的引物和探针组合，以能给出最低Ct值和最高荧光强度的组合为最佳组合。反应体系为25 μL：2× Taq PCR MasterMix 12.5 μL，上下游引物设定终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8 μmol/L，探针设定终浓度为0.12、0.16、0.18、0.2 μmol/L，ROXⅡ0.5 uL，模板DNA 50～100 ng，用dd H2O补足体系。反应条件：95℃30 s；95℃5 s，60℃35 s，40个循环。60℃时收集荧光。

2.3志贺氏菌ipaH实时荧光定量PCR方法的特异性实验

根据2.2中确立的最佳引物探针浓度和反应条件，水作为空白对照，提取表1中志贺氏菌和其他病原菌的基因组DNA进行实时荧光PCR扩增，通过观察扩增曲线验证所建立的志贺氏菌实时荧光PCR方法的特异性。

2.4志贺氏菌ipaH实时荧光定量PCR反应体系中IAC探针浓度和添加量的优化

在2.2中确定的靶基因最佳引物探针浓度基础上，对反应体系中内参探针浓度进行优化。探针终浓度分别设0.12、0.14、0.16、0.18 μmol/L，反应体系中包含106考贝的IAC，反应条件同前，以能给出最低Ct值和最高荧光强度的最小IAC探针浓度为最佳浓度。

IAC添加量过多会抑制靶基因的扩增，需要对IAC添加量进行优化。在其他条件已确定的基础上，在反应体系中添加102、103、104、105、106考贝的IAC，选取能获得IAC扩增阳性信号，同时又不影响靶基因扩增的添加量作为IAC最佳添加量。

2.5IAC对志贺氏菌ipaH实时荧光定量PCR方法的特异性影响

根据2.4中确定的IAC最佳探针浓度和添加量，建立加入IAC后的志贺氏菌实时荧光定量PCR （ipaH-IAC）反应体系。对表1中菌株提取基因组DNA，进行实时荧光PCR扩增，确定IAC添加后所建立的反应体系对志贺氏菌检测的特异性影响。

2.6 ipaH-IAC实时荧光定量PCR方法的灵敏性和定量范围

2.6.1灵敏性检测将已知浓度的志贺氏菌基因组DNA做10倍梯度稀释，每个稀释度各取1 μL为模板，按照ipaH-IAC实时荧光定量PCR方法，进行PCR扩增，能得到扩增曲线的最低浓度即为该反应体系检测的最高灵敏度。

2.6.2定量范围检测将志贺氏菌经过夜纯培养后，用灭菌PBS作10倍梯度稀释，并选择105、106、1073个稀释度进行平板计数，以此计算原始菌落数。每个稀释度各取1 mL菌液，用水煮法提取基因组DNA，用50 μL灭菌水溶解DNA，取1 μL为模板，进行PCR扩增。

2.7志贺氏菌实时荧光定量PCR检测标准曲线的构建

以志贺氏菌基因组DNA为模板，扩增ipaH靶基因，凝胶回收，连接到pMD19-T载体上，转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，将菌液送上海生工测序进行鉴定。

将鉴定正确的菌液提取质粒，并测定浓度，计算对应的拷贝数，做10倍列稀释，最终至1考贝/ uL，制成标准模板溶液，分别取1 μL作为模板进行ipaH和ipaH-IAC实时荧光定量PCR反应，通过不同Ct值和浓度，分别建立标准曲线，最终得到线性方程。分析比较两种方法的检测结果，确认IAC对志贺氏菌检测精确度的影响。

2.8 ipaH-IAC实时荧光定量PCR方法重复性和稳定性实验

将志贺氏菌纯培养物按10倍梯度稀释，取4个稀释度的样本分别作3个重复，用以上建立的方法在ABI7500进行扩增检测，计算Ct值的变异系数，评价实验结果的重复性。将试剂配制成试剂盒，考察试剂盒在-20℃条件下储存6个月后的稳定性。

2.9 ipaH-IAC实时荧光定量PCR方法对志贺氏菌模拟污染样本的检测

Establishment of Fluorescence Quantitative PCR Assay in Detection of Shigella Based on Internal Reference

WANG Jianchang，WANG Jinfeng，LI Jing，SUN Xiaoxia，CHEN Ruichun*
（The Technical center of Hebei entry-exit inspection and quarantine bureau，Shijiazhuang 050051，China）

Abstract：According to Shigella gene sequences published by Genbank，we selected specific target genes，designed specific primers and probes and optimized the reaction system. An internal amplification control（IAC）was added to reaction system. This IAC was detected by TaqMan probes labeled with different fluorophore. 5～50 CFU/25 g artificially contaminated sample was added to evaluate the performance of reaction system. The assay was could be used reliably for detection of Shigella with a sensitivity of 1pg/uL. For the 10 -fold dilutions bacteria DNA extracted by cooking water，the lowest detection limit was 9×103cfu/mL. But for the plasmid with ipaH，the lowest detection limit can reach 103copies /uL. The standard curve of ipaH and ipaH-IAC was established，and the quantification was linear between Ct and template copy number（R2=0.999）. While the initial sample amount of artificially contaminated bacteria was 10 CFU/25 g mutton，the Shigella could bebook=67,ebook=69detected after 6 hours culture. The ipaH-IAC fluorescence quantitative PCR assay was developed. It could not only be applied for detection of Shigella in food，but also monitor the PCR reaction system and prevent the false negatives. Therefore，the ipaH-IAC fluorescence quantitative PCR assay further ensures the reliability of the results and is conducive to the realization of standardized quantitative PCR method for Shigella in samples.

Keywords：Shigella，ipaH，Real Time PCR，IAC

*通信作者：陈瑞春（1963—），男，河北承德人，研究员，主要从事食品安全研究。E-mail：crcde@163.com

作者简介：王建昌（1981—），男，山东临朐人，农学博士，兽医师，主要从事食源性微生物、动物疫病病原的分子生物学检测研究。E-mail：18630135980@163.com

基金项目：质检公益性行业科研专项（201310126）。

收稿日期：2014-00-00

中图分类号：

文献标志码：A

文章编号：1673—1689（2016）01—0066—11