薛原，王晓菲，牛鑫鑫，廖聪，孙颖,田丽红

(东北林业大学野生动物资源学院，黑龙江哈尔滨150040)

鸡源沙门氏菌中磺胺类药物耐药基因的检测*

薛原，王晓菲，牛鑫鑫，廖聪，孙颖,田丽红

(东北林业大学野生动物资源学院，黑龙江哈尔滨150040)

采用K-B法检测35株黑龙江省鸡源沙门氏菌对磺胺类药物的耐药基因。根据耐药基因的流行情况，指导临床合理用药。结果表明，35株鸡源沙门氏菌对sulⅠ基因的阳性率为100%，sulⅡ基因的阳性率为68.6%，sulⅢ基因的阳性率为94.3%。

沙门氏菌；磺胺类药物；sulⅠ基因；sulⅡ基因；sulⅢ基因

随着抗菌药物的广泛应用，细菌耐药性很快出现。遏制沙门氏菌耐药性的传播和蔓延，防止沙门氏菌耐药菌株传播给人类已经成为世界关注的焦点。磺胺类药物是一类古老的化学合成抗菌药物，它们至今仍广泛用于细菌、原生动物和真菌的感染，具有抗菌谱广和价廉易得等特点[1]。磺胺类药物是二氢叶酸合成酶的竞争性抑制剂。这个酶是叶酸合成的关键性酶。由于磺胺类的滥用导致大量耐药菌株的出现，这给临床治疗带来很大困难。抗微生物药作为促生长剂在食源性动物中的广泛应用产生的抗菌药选择压力，促进了微生物耐药性的出现和传播。许多编码耐药性的基因可在动物和人类病原菌间水平传播，危害养殖业和人类健康。因此对沙门氏菌的耐药性检测在兽医和公共卫生上具有十分重要的意义。

在鸡沙门氏菌耐药基因的研究方面有相关报道[2-4]，但是我国大多停留在耐药表型上的研究[5-6]。本研究对35株鸡源沙门氏菌进行的磺胺类药物的耐药基因进行了扩增，比较了细菌的耐药性和耐药基因之间的关系。

1 材料

1.1 菌株质控菌:大肠杆菌ATCC25922，购自中国兽医药品监察所；临床菌株：来源于黑龙江省养殖场。

1.2 仪器和试剂质粒小量提取试剂盒、Taq酶宝生物工程(大连)有限公司产品；凝胶成相分析系统，美国Alpha Imager2200公司产品；PCR仪，德国Biometra公司产品。

2 方法

2.1 药敏试验将经鉴定的菌株接种到营养肉汤，振荡培养，在MH平板上涂抹均匀，用K-B琼脂扩散法进行药敏试验，置于37℃培养18h。抑菌圈直径解释标准参照美国国家临床实验室标准委员会的标准，每次试验均以大肠杆菌ATCC25922作为质控菌株。

2.2 耐药基因检测PCR扩增的模板为菌株质粒DNA和菌落。引物序列引自参考文献[2]，由上海英骏生物技术有限公司合成。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析，sulⅠ基因目的片段为425bp，sulⅡ基因目的片段为435bp，sulⅢ基因目的片段为792bp。

3 结果

3.1 药敏试验结果35株菌对磺胺类药物复方新诺明的耐药率为72%。

3.2 耐药基因检测结果以35株临床分离的鸡源沙门氏菌的质粒DNA为模板进行sulⅠ、sulⅡ、sulⅢ基因的检测。sulⅠ、sulⅡ、sulⅢ基因检测结果显示：sulⅠ、sulⅡ、sulⅢ基因PCR扩增阳性，其扩增片段大小与预期目的片段相符。sulⅠ、sulⅡ、sulⅢ基因PCR检测电泳结果见图1、2、3。35株鸡源大肠杆菌中，sulⅠ基因检出的阳性例数为35例，阳性率为100%；sulⅡ基因检出的阳性例数为24例，阳性率为68.6%；sulⅢ检出的阳性例数为33例，阳性率为94.3%。

图1 sulⅠ基因PCR扩增结果

图2 sulⅡ基因PCR扩增结果

图3 sulⅢ基因PCR扩增结果

4 讨论

沙门氏菌是一种广泛分布的食源性病原体，是严重危害人类健康和畜牧业发展的一类人畜共患病原菌。它寄生于人和动物的肠道内，在动物与人之间可通过直接或间接的途径进行传播，不需要中间宿主。不同国家和地区的养殖场由于其临床用药习惯、饲养管理水平、卫生条件及自然环境存在差异，因此致病性沙门氏菌的耐药表型特征也不相同。

抗微生物药应用几十年来，确实减少了动物的发病率和死亡率，提高了经济效益，但是在动物生产中，人们应慎用抗微生物药，以免为了一时的经济效益而威胁到人类自身的安全，从而付出更大的代价。沙门氏菌的耐药性可通过基因突变、外排泵、耐药基因编码的钝化酶和灭活酶产生、可移动的细菌遗传耐药基因元件产生及其转移等多种机制产生和传递，影响畜牧业生产和公共卫生安全。细菌对磺胺类药物容易产生耐药性，产生的原因是细菌产生了较多的PABA，或二氢叶酸合成酶结构改变，或者直接利用外源性叶酸。各磺胺类药之间可产生不同程度的交叉耐药。

临床上的革兰氏阴性肠道菌对磺胺类药物的抗性很大程度是经质粒介导的，主要是由于出现替代性的、对磺胺类药物亲和力更低的新二氢叶酸合成酶，即有抗性的DHPS。在革兰氏阴性肠道菌中，目前的研究共有两种具有对磺胺类药物抗性的二氢叶酸合成酶，其基因分别命名为sulⅠ、sulⅡ、sulⅢ。Swedberg等人研究了两个由质粒介导的酶，这两个基因的序列被检测出来，分别命为: sulⅠ、sulⅡ[7]。sulⅢ基因同sulⅠ基因和sulⅡ基因相比，只有40%和43.3%的同源率。沙门氏菌对磺胺类产生耐药性，除了以上出现由质粒介导对磺胺亲和力更低的二氢叶酸合成酶外，其它一些试验证明在染色体上的二氢叶酸合成酶的dhps基因经过突变，使二氢叶酸合成酶降低对磺胺类药的亲和力，从而产生抗性。

本研究的耐药基因检测结果表明，鸡源沙门氏菌磺胺类药物的耐药性已经相当严重，必须从细菌耐药性产生的分子机理方面研究,才能找到消除细菌耐药性的根本方法。为控制耐药性沙门氏菌感染的蔓延，研究畜牧业中抗菌素的使用造成食源性沙门菌耐药性变化与临床分离的耐药菌株之间的关系，加大对沙门氏菌耐药性监测力度是非常必要的。建议一种药物不要长期应用，可采取轮换用药的方式，避免耐药性的产生。

[1]AlSalim,T,Saeed,MEM,Hadi,JS,Zeino,M,Gany, R,Kadioglu,O,Titinchi,SJJ,Abbo,HS,Efferth,T. Cytotoxicity of Novel Sulfanilamides Towards Sensitive and Multidrug-resistant Leukemia Cells[J]. CURRENT MEDICINAL CHEMISTRY.2014,21(23): 2715-2725.

[2]马孟根，王红宁，余勇，等.猪源致病性沙门氏菌耐药基因的分析[J].畜牧兽医学报,2006,37(1),65-70.

[3]黄凯，陈素娟，黄骏，等.动物源性沙门氏菌的耐药性分析及氟苯尼考类耐药基因的鉴定[J].中国畜牧兽医，2015,42(2)：459－466.

[4]赵俊利，石瑞丽，李志芳，等.内蒙古地区奶牛源致病性沙门氏菌耐药性分析及ESBLS基因检测[J].中国畜牧兽医，2015,42(8):2150-2159.

[5]谭伟成，卢景.50株鸭源致病性沙门氏菌的分离鉴定及药物敏感性检测[J].上海畜牧兽医通讯，2011, 2:43-45.

[6]施开创，李凤梅，邹联斌，等.鸡源致病性沙门氏菌的分离鉴定及血清型和药物敏感性分析[J].中国畜牧兽医，2015，42(8)：2160－2168.

[7]Swedberg G,Skold O.Plasmid-borne sulfonamide resistance determinants studied by Restriction enzyme analysis[J].J Baeteriol,1983,153(3): 1228-1237.

Source of salmonella in chicken sulfa drug resistance gene detection

XUE Yuan，WANG Xiao-fei，NIU Xin-xin，LIAO Chong，SUN Ying，TIAN Li-hong
(College of wildlife resource o f Northeast Forest University，Harbin 150040，China)

K-B method is used to detect 35 salmonella strains in heilongjiang province chicken the source of sulfa drug resistant genes.According to the prevalence of drug resistant genes,to guide clinical rational drug use.The results show that the source of 35 strains of chicken salmonella to sulⅠgene positive rate was 100%,sulⅡgene positive rate was 68.6%, sulⅢgene positive rate was 94.3%。

salmonella;sulfonamides;sulⅠgene;sulⅡgene;sulⅢgene

Q343.1

B

1673-1085（2016）03-0010-03

编辑部版权页声明：

《家禽科学》杂志社

2016-02-21

国家自然科学基金（31502119）；黑龙江省博士后科研启动金（LBH-Q14002）。

薛原（1978～），女，汉族，黑龙江饶河人，讲师，博士，主要从事细菌耐药性方面的研究。

**通讯作者，E-mail:xueyuan-1978@163.com。

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