王琳　王雪　田静秒　宋云飞

【摘要】检测谷物中常见的真菌毒素。使用酶联免疫分析法检测黄曲霉毒素B1，呕吐毒素，玉米赤霉烯酮。黄曲霉毒素B1，呕吐毒素，玉米赤霉烯酮ELISA检测试剂盒的标准曲线的IC50分别为0.14，20.4，0.58 ng/mL。上述三种真菌毒素的添加浓度分别为5，500，25 ng/g，平均添加回收率分别为89.2%，94.8%，83.6%。该方法操作简便，准确性好，满足国家限量标准的要求。

【关键词】免疫分析黄曲霉毒素B1呕吐毒素玉米赤霉烯酮

引言

真菌毒素是是由微生物产生的毒素及毒素代谢产物，对人类健康能够产生严重危害。常见的真菌毒素有黄曲霉毒素，呕吐毒素，玉米赤霉烯酮等。

黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为1类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质。在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B1最为多见，其毒性和致癌性也最强[1]。呕吐毒素（Vomitoxin）又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），具有很高的细胞毒素及免疫抑制性质，对人类和动物都有很大危害，可以导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、头晕、腹痛等急性中毒症状[2]。玉米赤霉烯酮为2，4-二羟基苯甲酸内酯类化合物，具有很强的雌性激素作用，可引起动物的雌激素过多症和严重的生殖道症状及不孕症，还具有免疫毒性、肝毒性等，对肿瘤发生也有一定作用[3]。

因此，国家对真菌毒素制定了严格的限量标准，我国规定黄曲霉毒素B1在玉米及其制品中不得超过20 μg/kg，在大米等谷物中不得超过10 μg/kg，在小麦等谷物中不得超过5 μg/kg，脱氧雪腐镰刀菌烯醇在谷物及其制品中不得超过1000 μg/kg，玉米赤霉烯酮在谷物及其制品中不得超过60 μg/kg[4]。

酶联免疫分析法检测真菌毒素具有灵敏度高，检测时间短，操作简便，能够批量检测，便于现场大量样品快速筛查等优势。 本研究建立一种酶联免疫分析法，用于检测黄曲霉毒素B1，呕吐毒素，玉米赤霉烯酮，方法简便，准确度高，为进一步研究生物毒素的快速检测方法奠定了基础。

1 材料与设备

1.1 试剂与材料

黄曲霉毒素B1 ELISA检测试剂盒，呕吐毒素ELISA检测试剂盒，与玉米赤霉烯酮ELISA检测试剂盒，来自北京普析通用仪器有限责任公司。其他化学试剂购于西陇化工股份有限公司。

1.2 设备

酶标仪，北京普析通用仪器有限责任公司。

2 方法

2.1 前处理步骤

（1）将玉米样品粉碎，称取5.0 ± 0.05 g 粉碎后的样品；（2）加入25 mL 60% 甲醇，剧烈振荡 10 min；（3）4000 r/min，离心5 min；（4）取1 mL上清液，用4 mL样品稀释液进行稀释，混匀；（5）待测。

2.2 ELISA操作步骤

（1）加样：每孔依次加入样品，酶标物工作液，与抗体工作液，各50 μL；（2）孵育：室温孵育30 min；之后，用洗涤液洗涤五次。（3）显色：每孔加入显色液A与显色液B各50 μL，室温避光作用15 min。（4）每孔加入50 μL终止液，用酶标仪检测其450 nm处的OD值[5]。

2.3 添加回收率计算

在玉米样品中添加适当浓度的黄曲霉毒素B1，呕吐毒素，或玉米赤霉烯酮，按照2.1的步骤进行前处理，之后按照2.2的步骤检测，每个样品检测4次，计算添加回收率与平均值。添加回收率的计算方法：添加回收率 = （样品检测浓度 – 空白样品检测浓度）/ 添加浓度×100%。

3 结果

3.1 标准曲线

黄曲霉毒素B1的ELISA标准曲线见图1。由图1可知，黄曲霉毒素B1的IC50为0.14 ng/mL。

呕吐毒素的ELISA标准曲线见图2。由图2可知，呕吐毒素的IC50为20.4 ng/mL。

玉米赤霉烯酮的ELISA标准曲线见图3。由图3可知，玉米赤霉烯酮的IC50为0.583 ng/mL。

3.2 添加回收率

玉米中黄曲霉毒素B1，呕吐毒素，或玉米赤霉烯酮的添加回收率见表1，由表1可知，在玉米中添加5 ng/g黄曲霉毒素B1，平均添加回收率为89.2%，添加500 ng/g呕吐毒素，平均添加回收率为94.8%，添加25 ng/g玉米赤霉烯酮，平均回收率为83.6%，结果的准确性较好。

4 讨论

本研究采用酶联免疫分析法检测黄曲霉毒素B1，呕吐毒素，或玉米赤霉烯酮，平均添加回收率在80%到100%之间，准确性较好，可以满足国家限量标准[4]。本研究为开发检测真菌毒素的蛋白质芯片及方法奠定了基础。

蛋白质芯片的技术原理是，将各种蛋白质有序地固定于芯片基底上，然后样品中标记了特定探针的生物分子与芯片作用，目标分子与固定蛋白质通过抗原-抗体相互作用等原理结合，经过漂洗将未能与芯片上的蛋白质互补结合的成分洗去，再利用相应技术进行检测[6]。蛋白质芯片在医疗诊断[7]，食品安全[8]，环境监测[9]等领域具有重要应用价值，有报道称蛋白质芯片可以用于真菌毒素的检测。李建林等人建立一种用光子晶体微球流式芯片检测真菌毒素的方法，可以同时检测黄曲霉毒素、伏马毒素和桔青霉毒素[10]。王莹等人建立了一种蛋白质芯片检测方法，可以检测黄曲霉毒素B1，黄曲霉毒素M1等六种真菌毒素[11]。王莹等人还建立了一种悬浮芯片检测方法，可以检测呕吐毒素，T2毒素等四种真菌毒素[12]。

本研究的下一步计划是建立蛋白质芯片检测真菌毒素的方法，在蛋白质芯片上包被多种真菌毒素的合成抗原，组成真菌毒素的检测位点阵列，在芯片上加入待测物，抗体与荧光标记探针，通过免疫反应形成抗原-抗体-荧光探针复合物，使用荧光检测器检测信号。该方法与传统的酶联免疫分析方法相比，通量更高，而且可以同时检测多种真菌毒素，可以极大的缩短检测时间。

参考文献：

[1]马志科，昝林森.黄曲霉毒素危害、检测方法及生物降解研究进展[J].动物医学进展， 2009， 30（9）： 91-94.

[2]孙秀兰，邵景东，王俊双.粮油食品中呕吐毒素危害及风险分析[J].粮食与油脂，2006（3）： 41-43.

[3]王怡净，张立实.玉米赤霉烯酮毒性研究进展[J].中国食品卫生杂志，2002，14（5）： 40-43.

[4]GB 2761-2011 食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量[S].2011： 1-7.

[5]GBT 17480-2008 饲料中黄曲霉毒素B1的测定酶联免疫吸附法[S].2010： 1-5.

[6]陈艺心.蛋白质芯片构建技术的研究进展[J]. 国际检验医学杂志，2013，34（8）：989 - 991.

[7]农世泽，黄承乐，梁林慧.SELDI 蛋白质芯片技术在肝癌中的应用[J].检验医学与临床， 2013，10（10）：1276-1278.

[8]Joon Myong Song，Tuan Vo-Dinh. Miniature biochip system for detection of Escherichia coliO157：H7 based on antibody-immobilized capillary reactors and enzyme-linked immunosorbent assay. Analytica Chimica Acta，507（1）： 115–121.

[9]Udara Dharmasiri， Magorzata A Witek， Andre A Adams， et al. Enrichment and detection of Escherichia coli O157：H7 from water samples using an antibody modified microfluidic chip. Analytical chemistry，2010，82（7）：2844–2849.

[10]李建林，邓国哲，徐坤等.一种用光子晶体微球流式芯片检测真菌毒素的方法.中国， CN201210359576.8[P]， 2013-1-16.

[11] Wang T， Liu N， Gao Z X， et al. Simultaneous and rapid detection of six different mycotoxins using an immunochip. Biosens. Bioelettron， 2012， 34： 44-50.

[12]Y Wang， B Ning， Y Peng， et al. Application of suspension array for simultaneous detection of four different mycotoxins in corn and peanut.Biosensors & Bioelectronics，2013，41（8）：391–396.

第一作者及通讯作者简介：王琳（1980-），男，硕士，研究方向为快速诊断检测技术的研究开发和应用等。电子信箱：lin.wang@pgeneral.com.cn。