田恒　屠梦琪

摘要：研究了用于卷烟滤嘴的天然抗氧化剂活性的评价方法，同时验证了多酚类、黄酮类等天然抗氧化剂去除自由基的能力。研究结果表明：确定的适合于在实验室进行的对抗氧化剂的评价方法：HPLC法，考虑抗氧化剂的性能。分析得到的适于直接添加到卷烟滤嘴中的天然抗氧化剂：TP98%、TP35%、SIF40%、SIF20%、GSH。这5种抗氧化剂在去除稳定的自由基DPPH时都有较好的效果。以水：油=93：7（质量比）的比例添加天然抗氧化剂，对油剂的乳化没有影响。对样品水溶液分析了温度对其去除率的影响。

关键词：天然抗氧化剂；DPPH；HPLC；自由基

中图分类号：Q562 文献标识码：A 文章编号：1674-9944（2016）06-0190-04

1 课题主要任务和目标

研究目标为研究评价天然植物提取物抗氧化性的方法；根据评价结果筛选出合适的天然植物提取物抗氧化剂。

研究内容为查找文献总结出抗氧化剂的评价方法，并从中选择出适用于在实验室进行实验的方法；抗氧化剂的评价方法主要有：DPPH自由基清除法、FRAP法、β-胡萝卜索-亚油酸乳化液氧化法、硫代巴比妥酸反应物（TBARS）值法等多种方法，综合考虑这几种方法，选择出适于在实验室进行实验的方法。用所选的方法对茶黄素20%、茶多酚98%、茶多酚80%、茶多酚35%、大豆异黄酮40%、大豆异黄酮20%、红茶40%、番茄红索10%等抗氧化剂进行综合评价。观察抗氧化剂在油剂中的稳定性，评价温度对抗氧化剂活性的影响。

2 材料与方法

2.1 实验材料

主要仪器选用自动进样高效液相色谱仪1100型，美国Agileht公司；电子天平，上海精密科学仪器有限公司。

主要试剂选用无水乙醇（分析纯）；甲醇（分析纯）；茶黄素TF20%；茶多酚TP98%；茶多酚TP80%；茶多酚TP35%；大豆异黄酮SIF40%；大豆异黄酮SIF20%；红茶BTE40%；番茄红素LYC10%；谷胱甘肽GSH；ST-90油剂，南通醋酸纤维有限公司提供。

2.2 测定方法

DPPH自由基清除法是使用较广泛的一种抗氧化剂的评价方法，由于清除剂直接作用于DPPH·自由基，反应时间仅需20min左右，操作简单，且用一般的分光光度计即可测定，因此DPPH·法直接、灵敏、快速、简便。而其他3种方法如：FRAP法、β-胡萝卜素-亚油酸乳化液氧化法、硫代巴比妥酸反应物（TBARS）值法，也可用于评价抗氧化剂的效果，但是FRAP法一般用于非酶抗氧化剂，而且其TPTZ工作液的制备和反应温度要求较高；β-胡萝卜素-亚油酸乳化液氧化法其实验过程比较复杂，β-胡萝卜素-亚油酸乳化液的制备过程也很复杂；硫代巴比妥酸反应物（TBARS）值法，需要放入生物培养箱中，40±1℃下培养，96h后取出再经过一系列处理才可进行评价，所需时间较长。综合考虑以上4种方法，得出在实验室中进行的最适方法为：DPPH自由基清除法。

选取了现在市场上较主流的天然植物抗氧化剂包括绿茶提取物（茶多酚TP98、TP80和TP35）和红茶提取物（茶黄素）、大豆异黄酮、番茄红素以及本实验室通过微生物发酵提取得到的谷胱甘肽为比较对象，以1，1-联苯-β-苦基偕腙肼（DPPH）为标准自由基，通过分光光度法和HPLC方法评价各类天然抗氧化剂体外清除自由基的能力，对其作为卷烟去自由基添加剂作初步的筛选。

2.2.1 HPLC法

用DPPH比色法评价抗氧化剂的自由基清除能力具有一些不足之处，比如无法正确评价某些药物的抗氧化性，因为易受样品中一些色素的干扰。现在发展出一种简单、灵敏的HPLC化验方法用于评价草药的抗氧化能力。这种HPLC方法专用于DPPH，具有重复性好，可避免各种物质的吸光度的叠加，检测时间短的优点，适合于快速检测多个样品的自由基清除能力。

（1）HPLC实验参数。本实验中采用HPLC体系中最常用的反相色谱柱Hypersil ODS（4.6mm×200mm，4.6μm），使用甲醇/水（80/20，v/v）为流动相，实验温度25℃，以20“L进样，在波长517nm出检测DPPH出峰。在空白溶液与样品溶液之间DPPH峰面积（PA）的减少量被用来评价样品的清除率。（1）

（2）DPPH标准曲线的绘制。准确称取DPPH样品0.01g，用甲醇溶液定容至10mL，浓度1g/L，作为储备液，并将该溶液记作A溶液，甲醇溶液记作B溶液，去离子水溶液记作C溶液，梯度稀释情况如表1。

以不同浓度标准溶液的主峰面积对其浓度作图得到面积一浓度标准曲线图1。

（3）样品水溶液的清除效果。准确称取各样品0.01g，用去离子水定容至50mL，浓度0.2g/L，浸提2～3h，过滤后将该溶液记作A溶液；准确称取DPPH0.01g，用甲醇溶液定容至10mL，浓度1g/L，作为储备液，并将该溶液记作B溶液；将A、B两种溶液以1：1的比例混合放入自动进样器中，监测517nm波长下，3.8min时的主峰面积。

2.2.2 温度对抗氧化剂活性的影响

各取一定量的样品水溶液，于100℃水浴处理5min。分别取热处理的和未经热处理的各样品，用分光光度法评价。

2.2.3 抗氧化剂在油剂中的稳定性

纺丝油剂主要由7%（w/w）的矿物油（包括表面活性剂等）和93%（w/w）的水组成，通过改变水相的成份，在丝束上油的过程中，将选定的自由基清除剂均匀的涂布到丝束表面。需要解决的问题包括活性添加剂在油剂体系和后序加工过程中活性的保持以及对油剂乳化稳定性的影响。准确称量各样品0.05g，用去离子水定容至50mL，浓度1g/L。并将该溶液记作A溶液。南通醋酸纤维有限公司提供的ST-90油剂记作B溶液。将A、B溶液以93：7（质量比）的比例混合放于离心管中，并在超声波破碎仪下剪切5min，使油剂与抗氧化剂样品充分混合，静止放置，观察其稳定性。

3 结果与讨论

3.1 HPLC法评价结果

HPLC法评价结果见图2。

根据各样品反应后的主峰面积，及DPPH溶液空白的主峰面积，我们可以得到各样品的清除率，可与分光光度法进行比较。

3.2 温度对抗氧化剂活性影响的结果

温度对抗氧化剂活性影响的结果见图3。

由图3可知，经过高温热处理后，各样品的清除率与未经过热处理样品的清除率均没有太大变化，茶多酚、茶黄素、红茶和谷胱甘肽热处理后的清除率均有所下降，大豆异黄酮和番茄红素热处理后的清除率均有所提高。由于变化不大，可基本忽略温度对抗氧化剂的影响。

在后面的实验中，应浸提后直接加入到油剂中，制成卷烟后用模拟吸烟设备吸烟时再考虑高温处理后是否对各样品的清除率有影响。

3.3 抗氧化剂在油剂中的稳定性结果

各样品与油剂充分混合后，每天观察其乳化效果，持续两周，发现每个样品的乳化性均很好，没有出现分层的现象。说明加入抗氧化剂后对油剂的乳化性并没有影响，在油剂中添加抗氧化剂可行。

4 结论

本论文研究了用于卷烟滤嘴的天然抗氧化剂活性的评价方法，同时验证了多酚类、黄酮类等抗氧化剂清除自由基的能力，主要的研究结果如下。

（1）确定了适合于在实验室进行的天然抗氧化剂的评价方法：HPLC法。

（2）分析得到了适于直接添加到卷烟滤嘴中的天然抗氧化剂，其清除效率均较好TP98%、TP35%（85%～95%）、SIF40%（64.77%）、SIF20%（73.02%）、GSH（77.09%）且颜色较浅。这五种抗氧化剂在清除稳定的自由基DPPH时都有较好的效果，由于时间关系，没能做到将天然植物抗氧化剂添加到卷烟滤嘴中，实际评价其去除卷烟主流烟气中自由基的效果。

（3）以水：油=93：7（质量比）的比例添加天然抗氧化剂，对油剂的乳化没有影响。

（4）对样品水溶液分析了温度对其清除率的影响：经过高温热处理后，各样品的清除率与未经过热处理样品的清除率均没有太大变化，茶多酚、茶黄素、红茶和谷胱甘肽热处理后的清除率均有所下降，大豆异黄酮和番茄红素热处理后的清除率均有所提高。由于变化不大，可基本忽略温度对抗氧化剂的影响。在后面的实验中，应浸提后加到油剂中，制成卷烟后用模拟吸烟设备吸烟时再考虑高温处理后是否对各样品的清除率有影响。