陈高　陈禅友　高志鹏　宋靖仪　吴华

摘要：研究了不同浓度的生长素（NAA、2，4-D）和细胞分裂素（6-BA、KT）对豇豆[Vignaunguiculata（Linn.）Walp.]花荣下胚轴和子叶愈伤组织诱导的影响。结果表明，子叶较下胚轴更容易诱导出愈伤组织；子叶切片在MS+3.0mg/L2，4-D+0.5mg/LKT中愈伤诱导率最高，为95.83%，下胚轴茎段在MS+3.0mg/L2，4-D+0.1mg/L6-BA中愈伤诱导率最高，为88.89%。此外，2，4-D与KT组合可诱导子叶产生胚状体。

关键词：豇豆[Vignaunguiculata（Linn.）Walt）.]；外植体；愈伤组织；诱导；生长素；细胞分裂素

中图分类号：S643.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）09-2380-03

豇豆[Vignaunguiculata（Linn.）Walp.]是豆科豇豆属一年生草本植物。豇豆在中国品种资源丰富，历史悠久，适应性强，栽培范围广，是中国夏秋两季主要食用的蔬菜之一。新鲜的豇豆荚，维生素及矿物质含量丰富，蛋白质含量较高，其磷脂有利于促进胰岛素的分泌，是糖尿病人的理想食物。

植物组织培养是细胞工程技术中研究较早、较成熟的技术。在育种上已经得到普遍应用，如单倍体育种、细胞融合和基因工程等。此外。植物组织培养技术还被运用到人工种子的生产和种质资源的保存上，大大节约了人力、物力，避免了外界气候和其他环境因素对播种的影响。

近年来，国内外学者对豇豆组织培养进行了一些研究，包括基因型、外植体种类和大小、培养基种类、凝固剂、细胞分裂素前处理以及激素种类与配比等对不定芽和愈伤组织诱导的影响。基因型和外植体类型对不定芽和愈伤组织诱导的影响差异明显，至今尚未形成一种比较通用的豇豆不定芽和愈伤诱导的组培体系。本试验以豇豆花荣的下胚轴、子叶作为外植体进行豇豆愈伤组织诱导，研究不同激素配比的培养基对愈伤组织诱导产生的不同影响，找到适合豇豆花荣愈伤组织诱导的理想培养基，为豇豆的组织快速繁殖和品种改良研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

豇豆花荣种子，由湖北省豆类（蔬菜）植物工程技术研究中心提供。

选择无皱粒、饱满、大小均匀的豇豆种子，用75%乙醇浸泡消毒40s后，经无菌水冲洗2-3次：然后用升汞浸泡消毒9～10min，再用无菌水冲洗6-8次。将消毒后的种子接种于装有MS基本培养基的培养瓶中，每瓶4-5粒，在（23±2）℃、16/8h光照培养室中培养。种子萌发后，当幼苗高达到5-6cm、子叶转绿时作为外植体材料。

1.2 生长调节剂对无菌苗不同部位愈伤组织诱导的影响

分别切取幼苗的下胚轴和子叶作为外植体，接种至含有不同浓度NAA或2，4-D（1.0、3.0、5.0mg/L）与6-BA或KT（0、0.1、0.5mg/L）的MS培养基中，每个处理接种4皿，每皿接种12-16个外植体，4次重复。其中下胚轴切取大小在5mm左右，子叶横切段厚度在2mm左右。每15d换一次新鲜培养基，所有材料均是在（23±2）℃、16/8h光照培养室中培养。

接种后，每3d观察愈伤组织诱导情况，并记录愈伤组织诱导率、愈伤组织色泽状态等相应指标。同时进行拍照记录和形态解剖。

1.3 数据分析

愈伤分化率：诱导出愈伤的外植体数/外植体总数×100%：褐化率：褐化的外植体数/外植体总数×100%：胚状体诱导率：诱导出胚状体的外植体数/外植体总数×100%，所有数据均采用Microsoft Excel2003和SAS8.02软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同激素对豇豆子叶愈伤组织诱导的效果

预试验中发现，豇豆转绿且饱和的子叶较白色或转绿萎蔫的子叶愈伤诱导效果更佳，因此，本试验中均采用转绿且饱和的子叶进行试验。不同生长索及细胞分裂索处理对豇豆子叶切片15d愈伤诱导效果的差异明显（表1）。由表1可知，2，4-D比NAA更利于子叶愈伤组织诱导分化，随着2，4-D浓度的增高，褐化率明显降低，在3.0mg/L2.4-D+0.1mg/L6-BA培养基中，愈伤诱导率达到最高（100%），且额外添加KT比6-BA能显著增加愈伤组织中胚状体的形成比例。

MS+3.0mz/L2，4-D+0.5mg/LKT配置的培养基上形成的愈伤组织色泽黄亮，颗粒饱满，易分散，而褐化率仅为34.58%。切片分析结果表明，愈伤组织中所形成的胚状体。细胞壁薄。原生质较浓、细胞核较大，细胞正处于旺盛的分裂状态，生长速度快。由此可见，MS+3.0mg/L2，4-D+0.5mg/LKT是豇豆花荣子叶愈伤诱导与胚状体诱导的最佳培养基，愈伤诱导率为95.83%，胚状体诱导率为78.13%。

2.2 不同植物生长调节剂对豇豆下胚轴愈伤组织的影响

表2结果表明，2种生长素均能诱导豇豆下胚轴愈伤的形成，但在加入相同浓度的6-BA或KT时，2，4-D的愈伤诱导率较高、愈伤较为疏松，且褐化率明显降低。研究中发现，在2，4-D浓度相同。添加同浓度6-BA或KT时，KT的愈伤诱导率大部分高于6-BA，诱导出的愈伤大多为淡黄色。后期培养更易褐化。由此可见，MS+3.0mg/L2，4-D+0.1mg/L6-BA是豇豆花荣最佳的愈伤诱导培养基，愈伤诱导率为88.89%，褐化率为34.44%。

3 小结与讨论

愈伤诱导会因外植体的年龄、部位、生理状况而有所差异。包英华等研究豇豆丰产2号的愈伤组织诱导时，发现愈伤诱导率下胚轴>顶芽>上胚轴>真叶。本研究中，发现豇豆花荣子叶较下胚轴的愈伤诱导率高，且子叶能够诱导出胚状体。

植物生长素是影响外植体愈伤诱导和分化的关键。在豇豆愈伤诱导的研究中，Ramakrishnan等和Anand等发现1.5mg/L的2，4-D对胚性愈伤的诱导效果，在胚性愈伤及原胚形成这个阶段是最好的。对豇豆未成熟胚进行愈伤诱导时，较高浓度的2，4-D和较低浓度的6-BA配合使用，胚性愈伤的诱导率更高。在豇豆丰产2号的愈伤组织诱导的研究中，愈伤诱导率也因外源激素的浓度不同而有所差别，NAA和2，4-D的愈伤诱导效果大致相同，其最佳用量为2.0mg/L。本研究中发现，2，4-D对子叶和下胚轴的诱导效果均优于NAA，褐化情况较少。当2，4-D达到3.0mg/L时，只需要3～6d便能启动愈伤组织的发生，平均诱导率可高达70%。而NAA诱导的愈伤出愈率低。易褐化。但有利于生根。KT与2，4-D组合有利于子叶的愈伤诱导和胚状体的形成，而6-BA与2，4-D组合有利于下胚轴的愈伤诱导。

褐化主要是酶促褐变，而酶促褐变主要是由多酚氧化酶引起的。植物种类和基因型、外植体部位和生理状态、培养基成分和培养条件是影响褐化的因素。在本试验中发现，子叶比下胚轴茎段褐化严重，凡是较小、较薄、绿色较浅、带有机械伤的子叶容易发生褐化，较嫩带绿色的下胚轴褐化较轻，而较老的褐化较重。为了避免褐化过于严重，试验中缩短了继代周期，有效地改善了褐化。