王莹

摘 要：在现代质量体系验证的过程中，关于检验方法的验证十分重要，这对于质量控制的相关技术以及方法，包括手段是否具有科学性都产生了直接的影响，因此是质检体系中最为重要的组成部分，我国在相关规定中也指出，加强对无菌制剂的检验工作，应该采取科学合理的检验方法，并且如果出现检验条件出现改变时，那么也应该进行重新检验，以保证检验结果的准确性。本文重点对无菌制剂的检查方法进行介绍，并验证结果，希望对今后的工作有所帮助，可以进一步提升检验质量。

关键词：方法验证；无菌制剂；无菌检查

在检查药典中，无菌制剂都需要采用无菌检查法对其质量进行检验，观察是否真正呈现出无菌的状态，只有通过无菌检验后，才能保证无菌产品的出售。同时这也是无菌产品质量检验过程中一个重要组成部分。在微生物生长过程中，判断样品是否受到污染，就需要依靠无菌检查法才能实现。受到各种因素的影响，检验量、培养基质量以及无菌技术等都会在一定程度上影响着无菌检查的质量，因此需要我们更加深入的对其进行研究，以实现更加科学化与高质量的检验。

1 影响无菌检查结果的主要因素

首先，供试品的组分会对无菌检查结果产生一定的影响。受到供试品自身特点的影响，其内部极有可能含有抑制成分，如黄连就是典型的抑制成分，又或者含防腐剂以及辅料等，都会在一定程度上对微生物产生抑制的作用，对微生物造成不同程度的污染，这样一来，无菌检查的结果就会失去准确性，产生不同程度的损伤也是无法避免的。此外，受到不同原料产地的影响，加之生产工艺也不可能完全一致，尤其是在对中药制剂进行生产的过程中，即使是同一厂家生产的药品，在不同批次中微生物的生长还会具有差异性。所以说，这些因素都会对无菌检查结果带来不同的影响。其次，微生物自身就具有多样性与复杂性的特点。在自然界中，微生物都是以不同形态或者在不同的环境中生存下来的，所以在生长过程中所受到的污染也有可能具有差异性的特点。当同样的产品放在不同的生产区域中时，微生物受到污染的形态也极有可能不同，因此，运用同样一种检查方法并不能完全保证准确的检验出结果，从公平性上也是不公平的。所以在对无菌制剂进行检验的过程中，应该充分考虑到微生物自身所具有的特点，再选取合适的检查方式进行检验，这样才可以保证检验结果的准确性。第三，在对无菌制剂中的微生物进行检验的过程中，检查方法是相当重要的。其中包含以下几个方面的内容，一是供试液的制备方法，二是微生物的检测方法，只有选择了适宜的检查方法，才能有效的实现检验结果的准确性。在对微生物进行检验时，应该先进行供试液的制备，供试品具有不同的特性，所以制备的方式也不尽相同。因此在这一过程中多少会对微生物的生长产生一定的影响，如果运用同样的供试液检验微生物，那么结果可能也会有所差异，并且供试液的浓度会直接对供试品产生抑制性的作用，这些都是需要考虑的因素。第四，在检验条件方面，微生物之所以会在检验过程中受到污染，与检验条件这一因素具有密不可分的关系。因为微生物在培养基中生长的过程中，检验的目的就是要对微生物是否受到污染进行判断，所以检验条件是直接的影响因素，例如培养时间的不同，亦或是培养基的质量具有差异性，都会对检验结果产生直接的影响，造成误差的出现。另外，受到外界因素的影响，如检验人员的手段不娴熟，因为其失误造成的问题，也都会影响到检验结果的真实可靠性。

2 对无菌制剂中微生物检验方法的要求

首先，对验证的类型具有一定的要求。验证类型可以分为以下几个部分。如前验证，前验证是在建立药品无菌的检验方法时进行的验证；再验证，这主要是在对无菌检验方法进行修订时进行而展开的验证；另外还包括定期方法验证，主要是当供试品的组分出现改变时，如果对检验结果产生一定的影响，那么就需要进行定期方法验证。其次，对于验证的主要内容而言，主要是用于对抑制细菌、抑制真菌而进行的验证试验，另外，在对供试品进行处理时，也需要进行验证试验，上述验证试验中所采用的方法以及环境等是否符合验证的要求也需要经过无菌检查后才能判定。第三，还应该对验证试验中所产生的关键性因素进行考量。试验菌中主要包含了对试验菌种类的选择，对菌种的具体要求以及对试验菌液进行制备，这些都是需要考虑的因素，如果想要令实验结果更加准确与公正，就要保证严格按照上述的要求进行验证，这样才可以有效的避免出现问题。

3 验证方法

3.1 菌种选择

无菌检查法的验证试验选择了以下6株菌：金黄色葡萄萄球菌，代表革兰阴性菌；铜绿假单胞菌或大肠埃希菌（用于抗革兰阴性菌为主的供试品）代表革兰阴性菌；生孢梭菌代表厌氧菌；白色念珠菌代表酵母菌；黑曲霉代表霉菌；枯草芽孢杆菌是代表药品中常见的污染菌-芽孢杆菌。选择的菌株都是微生物试验中常用的控制菌，且为标准菌株。每一试验菌均应进行验证试验，根据各菌株所代表的微生物种类进行验证试验，如金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌代表好氧细菌和厌氧菌，培养基采用硫乙醇酸盐流体培养基；而白色念珠菌和黑曲霉代表真菌，培养基采用改良马丁培养基。

3.2 菌种要求

无菌检查方法验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），以保证试验菌株的生物特性。

3.3 菌液制备

取经30℃～45℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌，铜绿假单胞菌营养肉汤培养物、取经35℃培养18～24h的生孢梭菌流体硫乙醇酸盐液体培养物、取经23℃～28℃培养24～48h的白色念珠菌改良马丁液体培养物、取经23℃～28℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，加3～5mL0.9%无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液分别稀释，制成约含菌10～100cfu/mL。

3.4 供试品的取样和处理

无菌产品中个成分的含量应该是均匀的，因此只要确定在验证的方法中，按所需的总接种量即可，而不必强求按规定的容器数取样。如果供试品需要溶解、稀释、乳化等处理，则必须确认这些处理对微生物无影响。

3.5 验证实验

薄膜过滤法的验证。分别做供试品组及对照组，与对照组比较供试品组微生物的生长情况。冲洗次数及冲洗体积同时要在验证试验中得到确认。直接接种法的验证。分别做供试品组及对照组，与对照组比较供试品组微生物的生长情况。结果判断与薄膜过滤法的验证相同。

4 需要注意的问题

培养基的适用性检查包括培养基的无菌性检查和培养基的灵敏度检查，验证试验的培养基适用性检查必须符合要求。菌株选择的原则为具有代表性、普遍性、易存活、在该制剂中常见的污染菌。为安全起见，试验菌株应选择同类菌种中的低或非致病性的标准菌株；另外，试验菌株宜选择生物活性比较稳定的菌株，有利于实验结果的重现。实验室菌种的处理和保藏的程序应标准化，尽可能减少菌种污染和避免生长特性的改变。验证试验用的菌悬液并不是只要活的菌体就行，而是要保持旺盛的生命力，所以，菌悬液存放时间不能太长。除黑曲霉孢子菌悬液外，其它试验菌液使用期限不超过24h，并应置4℃冰箱保存。

结束语

综上所述，通过开展验证工作，积累了大量的经验和数据，使无菌制剂的无菌检查的验证方法已经具有较明确的思路和方法，增加了试验的可操作性；尤其强调应充分验证供试品本身对微生物生长的影响，提高供试品的阳性检出率，使无菌检查方法更具科学性，保证检验结果的准确性，为控制无菌制剂的质量奠定了基础。

参考文献

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