水果果肉中总DNA提取方法的比较研究

2016-05-11齐玲倩刘秀丁梦璇刘远远柯润辉尹建军中国食品发酵工业研究院北京100015

食品研究与开发 2016年5期

关键词：水果

齐玲倩，刘秀，丁梦璇，刘远远，柯润辉，尹建军（中国食品发酵工业研究院，北京100015）

水果果肉中总DNA提取方法的比较研究

齐玲倩，刘秀*，丁梦璇，刘远远，柯润辉，尹建军
（中国食品发酵工业研究院，北京100015）

摘要：为了获得高效通用的水果果肉DNA提取方法，本研究以11种水果为试验材料，从前处理方法、裂解液成分、异丙醇沉淀时间等方面对CTAB法进行了改进，并比较了行业标准法、试剂盒法、改良CTAB法3种方法的提取效果，发现改良CTAB法提取的水果果肉DNA浓度都在46.25μg/mL以上，纯度都在1.8左右，且能扩增出137bp的18SrDNA条带，从而确定了高效通用的水果果肉DNA提取方法:改良CTAB法。

关键词：水果；DNA提取；改良CTAB法

果汁是重要的健康饮品，但如今果汁掺假问题日趋严重，例如在苹果汁中掺加梨汁或白葡萄汁，在橙汁中掺加柑橘汁、西柚汁、胡柚汁，在红色浆果汁中掺加苹果汁等[1-2]，这对消费者的利益和国际贸易的进行造成了极大的损害，因此亟待建立果汁中水果成分的检测方法。基因检测方法以其特异、快速、灵敏、准确的特点而广泛应用在果汁中水果成分的鉴定上[3-9]。

作为标准品或阳性对照品的水果DNA的提取，是运用基因检测方法鉴定果汁中水果成分的前提。但是，水果果肉中富含的多酚类物质能使DNA氧化成棕褐色凝胶状物，多糖类物质能与DNA结合成黏稠的胶状物[10-14]，这严重影响其DNA的提取。目前，国内外关于从水果果肉中提取DNA的研究较多，其提取方法主要有试剂盒法和改良十六烷基三甲基溴化铵（Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide，以下简称CTAB）法，李富威等[15-16]应用天根试剂盒提取多种水果中的DNA，建立了食品中木瓜和香蕉成分的基因检测方法；韩建勋等[17]使用改良CTAB法提取多种水果果肉的DNA，建立了果汁中梨成分的实时荧光定量聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，以下简称PCR）检测方法；Ng，C.C.等[18]利用由改良CTAB法提取的水果果肉的DNA进行果汁真实性的鉴别。此外，在标准SN/T 3729-2013《出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法第2部分：杏成分检测实时荧光PCR法》[19]中也包含了果实DNA的提取方法。但是，目前为止，鲜见报道这3种方法的比较研究。

本研究以11种水果为供试材料，比较了试剂盒法、改良CTAB法和行业标准法在DNA提取上的效果，以期获得高效通用的水果果肉DNA提取方法，为后续的分子生物学检测提供参考。

1　材料与方法

1.1材料

11种供试水果（木瓜、苹果、梨、葡萄、芒果、香蕉、桃、山楂、菠萝、橘、橙):均购自北京超市，分别对其编号木瓜A、苹果B、梨C、葡萄D、芒果E、香蕉F、桃G、山楂H、菠萝I、橘J、橙K。

1.2试剂

DNA提取试剂：CTAB裂解液（0.1 mol/L Tris-HCl、1.4 mol/L NaCl、0.02 mol/L Na2EDTA、20 g/L CTAB，pH=8）、CTAB沉淀液（5 g/L CTAB、40 mmol/L NaCl）、分离液（700 mmol/L NaCl、0.01 mol/L EDTA、0.1 mol/L Tris-HCl、2 % PVP-40，pH=8）、CTAB核裂解液（0.1 mol/L Tris-HCl、1.4 mol/L NaCl、0.05 mol/L EDTA、20 g/L CTAB、2 % PVP-40，pH=8）、1.2 mol/L NaCl溶液、3.2 mol/L NaCl溶液（pH=5.2），Tirs饱和酚/氯仿（25∶24，体积比）、氯仿/异戊醇（24∶1，体积比）：均为国家食品质量监督检验中心分子实验室自制；其它试剂或溶剂均为分析纯级或生化纯级。

DP305植物基因组提取试剂盒、RNaseA酶、DNA Marker DL 2000、Goldview：天根生化科技有限公司；应用于PCR扩增的Buffer、dNTPs、Taq DNA聚合酶:北京全式金生物有限公司；BSA（Bovine Serum Albumin，牛血清白蛋白）：北京六合通经贸有限公司；PCR扩增引物：由英潍捷基（上海）生物有限公司合成。

1.3仪器与设备

5804R型，5424型离心机：德国Eppendorf公司；微量移液器：德国Eppendorf公司；Biodrop超微量核酸蛋白分析仪：英国柏点公司；普通PCR扩增仪：英国BIOMETRA公司；JY-300C电泳仪：北京君意仪器公司；QUANTUM ST4凝胶成像仪：法国VILBER公司。

1.4DNA提取方法

用以下3种方法从水果果肉中提取DNA。

1.4.1行业标准法

参见行业标准SN/T 3729-2013《出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法》[19]中的果肉DNA提取方法。

1.4.2试剂盒法

1.4.3改良CTAB法

称取0.25 g果肉于预冷的2 mL离心管内，依次加入预冷的钢珠、0.5 mL分离液和30 μL 2 %的β-巯基乙醇，放入预冷的样品破碎仪里破碎均匀，再加入1 mL分离液混匀。冰浴静置10min，4℃，12 000r/min离心10min，弃上清，在沉淀中加入600 μL分离液，混匀，4℃，12 000r/min离心10min，弃上清，在沉淀中加入700 μL CTAB核裂解液，14 μL β-巯基乙醇，混匀，65℃温浴1 h，期间不时轻轻摇动离心管几次，取出后，加入等体积Tirs饱和酚/氯仿，振荡混匀，静置5min，4℃，12 000r/min离心10min，取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇，振荡混匀，静置5min，4℃，12 000r/min离心10min，取上清，加入1/10体积3.2 mol/L NaCl，等体积预冷的异丙醇，混匀，-20℃静置1 h，4℃，12 000r/min离心15min～20min，弃上清，70 %乙醇洗沉淀2次，倒置晾干后加入30 μL双蒸水，混匀，-20℃保存。

1.5DNA的浓度和纯度检测

DNA的纯度是由260 nm和280 nm处的光吸收（即OD260/OD280）的比值决定的。取果肉DNA溶液1 μL，用超微量核酸蛋白分析仪测定其浓度和纯度，每个样品重复测定3次。

1.6PCR反应及电泳检测

采用引物18SrDNA-F（5′-TCTGCCCTATCAACTT TCGATGGTA-3′）和18SrDNA-R（5′-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3′），扩增植物内源基因18SrDNA基因（扩增片段长度137 bp）[19]以检测DNA的质量。PCR反应体系为：10×PCR扩增缓冲液[含（NH4）2SO4及Mg2+]2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、10 μmol/L引物0.5 μL、5 U/μL Taq DNA聚合酶0.25 μL，20 mg/mL的BSA 0.2 μL，模板DNA量为2 μL，加入双蒸无菌水（ddH2O）将总体积调整为25 μL。PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环；72℃延伸5min；4℃下保温。

反应结束后，用2 %的琼脂糖凝胶电泳分析结果。

2　结果

2.1DNA提取结果

用行业标准法、试剂盒法以及改良CTAB法提取11种果实（A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K）的基因组，用Biodrop超微量核酸蛋白分析仪测定以上3种方法提取的DNA的纯度和浓度，结果见表1。

表1　不同提取方法提取的果实DNA的浓度和纯度（a±SD，n=3）Table 1 DNA yields and purity of fruit pulp from different extraction methods（a±SD，n=3）

从表1数据可以看出，试剂盒法（天根植物基因组提取试剂盒）对于果实样品木瓜（A）、芒果（E）、香蕉（F）、菠萝（I）、橘（J）的DNA提取效果良好，但无法从其他果实样品中提取出核酸。行业标准法在提取芒果（E）DNA时，效果较好，也可以从木瓜（A）、葡萄（D）、香蕉（F）、桃（G）、菠萝（I）、橘（J）中成功提取DNA，但浓度较低，而在其他果实样品DNA提取时，效果较差。改良CTAB法提取的DNA样品的OD260/OD280接近1.8，且DNA含量更高，说明使用改良CTAB法更适合提取果实DNA。其中，应用改良CTAB法提取葡萄（D）DNA时浓度相对较低，可能是由于花青素或酚类物质的存在，影响了核酸的释放。

2.2PCR扩增结果

用真核生物通用引物18SrDNA基因对改良CTAB法提取的11种水果果肉的基因组DNA进行PCR检测，琼脂糖凝胶电泳结果见图1。

图1　水果果肉基因组18SrDNA基因PCR电泳检测图谱Fig.1 Electrophoresis profile of PCR products amplified by 18SrDNA gene primer in different fruit pulp

如图1所示，使用改良CTAB法提取的DNA样品，均可扩增出片段大小为137 bp的18SrDNA基因条带，且条带明亮清晰，说明提取的果汁基因组DNA质量较好，可用于后续的PCR检测研究。

3　讨论

本试验采取3种DNA提取方案从果实中提取DNA，通过比较DNA的纯度、浓度，检验PCR扩增效率，确定了提取效率较高的方法-改良CTAB法，该方法针对果肉中含富含多糖、多酚、色素及次生代谢物的问题，对传统CTAB法进行了以下改进:

1）前处理方法：针对果肉中多糖、多酚及色素含量多的特点，采用预加分离液进行破碎，一方面分离液中含PVP-40和β-巯基乙醇，可有效防止多酚氧化；另一方面预加分离液洗涤果肉，可去除部分可溶性多糖和水溶性色素杂质，利于后续操作的进行，提高了DNA的提取效率。同时，DNA的释放受果肉样品破碎程度的影响，本试验采用样品破碎仪进行破碎，相对于较为常用的研钵研磨法，方便快捷，提高了样品破碎的效率。

2）裂解液成分：针对植物样品中多酚含量多的特点，在CTAB核裂解液中加入2 %（体积分数）的PVP-40和2 %（体积分数）的β-巯基乙醇，进一步抑制多酚氧化，阻止多酚氧化物与DNA的不可逆结合，从而提高DNA的质量及PCR扩增效率。

3）异丙醇沉淀时间：Sonia Ramos-Gómez等[20]研究发现沉淀时间对于DNA纯度有重要影响，沉淀时间越长，DNA浓度越高但纯度越低，考虑到DNA的浓度、纯度以及提取过程的时耗，选择在-20℃下沉淀1 h。

另外，在试验耗时方面，试剂盒法提取DNA的总时间大约是3.0 h～3.5 h，但是提取果肉DNA的效果不理想，利用行业标准法从果肉中提取果肉DNA所用的总时间大约是6.0 h～6.5 h，而改良CTAB法则为4.5 h～5 h，耗时少；在经济性方面，行业标准法提取果肉DNA所需的果肉为500 mg，而改良CTAB法所需的果肉为250 mg，耗费的原料较少，同时改良CTAB法的花费大约为3.5元，低于天根试剂盒法的二分之一。

综上所述，最终建立的不同果实的有效通用DNA提取方法-改良CTAB法，简化了试验步骤和时间，缩减了实验耗费，提高了DNA的提取效率，可为以后的果汁真实性基因检测提供参考。

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Comparative Study on DNA Extraction from Fresh Fruit

QI Ling-qian，LIU Xiu*，DING Meng-xuan，LIU Yuan-yuan，KE Run-hui，YIN Jian-jun
（China National Research Institute Food & Fermentation Industries，Beijing 100015，China）

Abstract：In order to obtain an efficient and general DNA extraction method from fresh fruit，eleven kinds of fruit were taken as experimental material，the CTAB method was developed from several aspects，such as the pre-treatment methods，the composition of lysis buffer，the time of Isopropyl alcohol precipitation and so on.Furthermore，the three methods were compared on their extraction efficiency which included industry standard method，DNA extraction kit method and modified CTAB method.The results showed that modified CTAB method was the most suitable for the DNA extraction from fresh fruit，the concentration of isolated genomic DNAs was in more than 46.25 μg/mL，the value of OD260 / OD280 was close to 1.8，and the isolated genomic DNAs also amplified the 137 bp size banding of endogenous 18SrDNA .

Key words：fruit；DNA extraction；modified CTAB method

DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2016.05.014

作者简介：齐玲倩（1989—），女（汉），在读硕士研究生，研究方向:果汁真实性的分子鉴别方法。

*通信作者：刘秀（1979—），男（汉），高级工程师，主要从事食品真实性检测。

收稿日期：2015-05-22