朱骏 朱克祥 李汛 张峰, 袁得峰 周琪 金强

胆囊癌中Bim ID1和E2F1的表达及生物学意义

朱骏1朱克祥3李汛2张峰2,3袁得峰4周琪1金强1

(1.兰州大学第一医院东岗院区 病理科， 甘肃 兰州，730000；2.兰州大学第一医院普外2科， 甘肃 兰州，730000；

3.兰州大学第一医院东岗院区 肿瘤内科, 730000；4.兰州大学第一医院东岗院区 普外科，甘肃 兰州 730000)

目的 探讨Bim、ID1和E2F1蛋白在胆囊癌组织中的表达及意义。方法 应用组织芯片技术，免疫组织化学SP法对70例胆囊癌、20例高级别上皮内瘤变、30例低级别上皮内瘤变和20例胆囊炎症组织进行Bim、ID1和E2F1蛋白检测。结果 在胆囊癌、高级别上皮内瘤变、低级别上皮内瘤变和炎症组织中，Bim阳性表达率分别为27.1%，30%，60%，65%，四组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；高级别上皮内瘤变与低级别上皮内瘤变之间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。ID1表达在四组中的阳性率分别为70%，65%，23.3%，20%，四组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；高级别上皮内瘤变与低级别上皮内瘤变之间，差异有统计学意义(P<0.05)。E2F1表达在四组中的阳性率分别为84.3%，75%，16.7%，10%，四组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；高级别上皮内瘤变与低级别上皮内瘤变之间，差异有统计学意义(P<0.05)。Bim与胆囊癌分化程度负相关(P<0.05)；与临床Nevi分期无关(P>0.05)。ID1和E2F1与临床Nevin分期相关(P<0.05)，与胆囊癌分化程度无关(P>0.05)。Bim分别与ID1、E2F1负相关(P<0.05)。生存分析Bim阳性患者生存率显著高于ID1和E2F1阳性患者(P<0.05)。结论 Bim、ID1和E2F1与胆囊癌的发生相关；联合检测Bim、ID1和E2F1对胆囊癌早期诊断及判断预后有重要的指导意义。

胆囊癌； Bim； ID1； E2F1

胆囊癌是胆道系统最常见的恶性肿瘤，占全球胆道癌的80%～90%，占消化道恶性肿瘤的第5位[1]。多见于55～75岁。西北地区好发。在所有胆囊切除手术中胆囊腺癌占5%。众多研究证实，细胞增殖失控在肿瘤的形成过程中发挥重要作用。而细胞增殖受多种因子调控，如凋亡调控因子Bim[2]，DNA结合抑制因子ID1[3]， 核转录因子E2F1[4]。本研究采用免疫组织化学方法检测Bim、ID1和E2F1在胆囊癌、上皮内瘤变以及炎症组织中的表达，探讨其在胆囊癌中的发生机制及生物学意义。

1 材料和方法

1.1 标本来源 收集兰州大学第一医院病理科及兰州大学第一医院东岗院区，自2000年～2013年12年间经手术并病理检查证实胆囊腺癌标本70例，按国际病理分级，高、中、低分化型分别为21例、27例和22例。另取20例高级别上皮内瘤变、30例低级别上皮内瘤变及20例胆囊炎症标本作为对照。年龄37～78岁，中位年龄57岁。

1.2 构建组织芯片及免疫组化染色 构建组织芯片：组织芯片由兰大一院东岗院区病理科制备。所有供体组织蜡块行常规病理切片后做HE染色，病理专家作二次诊断，并在切片的典型病理区域做出标记，后再在相应蜡块上做出标记。用组织芯片制作仪在模具蜡块上打出间距为 1 mm 直径为 2mm 的孔。在标记好的组织蜡块标记区域取材，用组织芯片制作仪钻孔采集直径 2 mm 的组织芯，将组织芯放到模具蜡块相应的孔内。重复上述步骤制成阵列块 5块。以 4 μm 厚度进行连续切片，40℃ 裱片，56℃ 烤片 3 h后移至 37℃ 恒温箱中过夜，常温保存备用。所得组织芯片的每个点都经过病理诊断。同时制成组织芯片 H E切片，对所得组织芯片的每个点都重新进行形态观察。缺失的点由对应石蜡包埋组织切片补充。

二甲苯和梯度酒精各15min脱蜡，柠檬酸盐缓冲液修复抗原，3%H2O2室温封闭15min，羊血清(ZSGB-BIO)封闭15min，分别加Bim、ID1和E2F1一抗(Santa Cruz)，4℃过夜；室温复温30min，山羊抗兔二抗(ZSGB-BIO)温室孵育15min，链霉卵白素(ZSGB-BIO)孵育15 min， DAB(ZSGB-BIO)显色，自来水终止反应，苏木素复染，分化返蓝，脱水封片。

染色结果处理：以细胞质中有棕黄色颗粒为阳性细胞。E2F1和ID1均以细胞质或核膜染色为主，Bim以细胞质为主。阳性判断标准为该位置出现了棕黄色或棕褐色颗粒状，并用阳性片作为对照，每张切片随机选择10个视野，40×10高倍显微镜下观察计数方法。根据染色的浓度及阳性细胞的数量分别记分。不着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。无阳性细胞染色为0分，阳性细胞数少于10%为1分，11～50%为2分，51%以上为3分。根据染色深度与阳性细胞数得分之和分为4级，即(-)为0分，弱阳性(+)为1～2分，阳性(++)为3～4分， 强阳性(+++)为5～6分[5]。染色深度与阳性细胞数得分之和大于3分为阳性表达。

1.3 统计学处理 采用四格表的精确概率法，所有数据采用SPSS 19.0统计软件分析应用2检验，Bim和ID1、E2F1之间应用Spearman相关分析，应用Kaplan-Meier法生存分析，取显著性检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 Bim、ID1和E2F1在胆囊病变组织中的表达特征 本研究利用免疫组化检测Bim、ID1和E2F1在胆囊癌、高级别上皮内瘤变、低级别上皮内瘤变和炎症组织中的表达。对其进行细胞定位，阳性信号呈现棕黄色。Bim表达于胆囊腺上皮及癌细胞的细胞质，ID1和E2F1表达于胆囊腺上皮及癌细胞的细胞核或细胞质，见图1。

图1 Bim、ID1和E2F1在胆囊癌、高级别上皮内瘤变、低级别上皮内瘤变和炎症组织中的表达

Figure 1 The expression of Bim，ID1 and E2F1 in gallbladder cancer, high level intraepithelial neoplasia, low level intraepithelial neoplasia and inflammatory tissues

2.2 Bim、ID1和E2F1在胆囊病变组织中的表达 对Bim、ID1和E2F1在胆囊癌、高级别上皮内瘤变、低级别上皮内瘤变和炎症组织中的表达进行统计，见表1。 Bim表达在4组中的阳性率分别为27.1%，30%，60%，65%，4组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；胆囊癌与高级别上皮内瘤变，高级别上皮内瘤变与低级别上皮内瘤变，低级别上皮内瘤变与炎症之间，相邻两组之间比较，高级别上皮内瘤变与低级别上皮内瘤变之间，差异有统计学意义(P<0.05)。ID1表达在四组中的阳性率分别为70%，65%，23.3%，20%，4组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；相邻两组之间比较，高级别上皮内瘤变与低级别上皮内瘤变之间，差异有统计学意义(P<0.05)。E2F1表达在四组中的阳性率分别为84.3%，75%，16.7%，10%，4组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；相邻两组之间比较，高级别上皮内瘤变与低级别上皮内瘤变之间，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 Bim、ID1和E2F1在胆囊癌、上皮内瘤变和增生组织中的表达

注:Bim、ID1和E2F1在胆囊病变组织中表达，4组比较，差异有统计学意义，①P<0.05；相邻两组比较，高级别上皮内瘤变与低级别上皮内瘤变之间，差异有统计学意义，②P<0.05。

2.3 Bim、ID1和E2F1与胆囊癌临床病理特征之间的关系 Bim、ID1和E2F1在胆囊癌组织中的表达与其分化程度和临床Nevin分期的关系，结果如表2所示。Bim表达，Nevin分期Ⅰ～Ⅲ期中阳性表达高于Ⅳ～Ⅴ期，但差异无统计学意义P>0.05；高分化组阳性率显著高于中、低分化组，差异具有统计学意义，P<0.05。E2F1和ID1在Nevin分期Ⅰ～Ⅲ期组织中阳性率显著高于Ⅳ～Ⅴ期，差异有统计学意义P<0.05；E2F1和ID1表达，高分化组阳性率高于中、低分化组，但差异具无统计学意义，P>0.05。

表2 胆囊癌中Bim、ID1和E2F1与临床病理联系

注：①Bim表达，胆囊癌高分化与中-低分化两组比较，差异有统计学意义，P<0.05。ID1、E2F1表达，胆囊癌临床分期Ⅰ～Ⅲ期，Ⅳ～Ⅴ期两组比较，差异有统计学意义，P<0.05。

2.4 胆囊癌中Bim、ID1和E2F1的相关性 胆囊癌组织中，Bim与E2F1负相关(r=-0.531，P<0.05)，Bim与ID1负相关((r=-0.301，P<0.05)，见表3。

表3 胆囊癌中Bim、ID1和E2F1的相关性

注：①Bim分别与ID1和E2F1比较，负相关，P<0.05

2.5 Bim、ID1和E2F1与胆囊癌患者生存率之间的关系 胆囊癌患者Bim阳性表达生存率高于ID1和E2F1表达，差异有统计学意义，P<0.05，见图2。

3 讨论

胆囊癌是胆道系统最常见的恶性肿瘤，近年来发病呈上升趋势，且起病隐匿，恶性程度高，预后极差[6-8]。细胞凋亡与增殖在肿瘤发生及发展过程中发挥重要的作用。

图2 胆囊腺癌Bim、ID1和E2F1阳性患者Kapan-Meier生存曲线

Figure 2 Expression of Bim,ID1和E2F1 in Gallbladder carcinoma patients texted to be translated Kapan - Meier survival curve

Bim基因属于Bcl-2家族，含有BH3结构域，后者是细胞凋亡起始的必需因子[7]。 Bim在多种正常细胞中均有表达，通过PI3K/PKB途径导致转录因子Foxo3a活化，上调Bim的表达引起癌细胞凋亡[10]。 Bim在乳腺癌、子宫内膜癌中低表达或表达缺失[11]，本组实验， Bim在胆囊癌、高级别上皮内瘤变、低级别上皮内瘤变、炎症组织中表达逐渐上调，提示Bim在胆囊病变中通过上调细胞凋亡抑制肿瘤。

分化抑制因子ID1是ID蛋白家族中的一种亚型，是螺旋-环-螺旋转录因子家族的成员之一。已有报道证实ID1已有报道证实ID1可以通过参与细胞周期素D对c-myc蛋白表达的依赖性途径，促进细胞增殖[12]，且是淋巴结阴性乳腺癌患者的独立预后因子[13]，Gupta等人发现在人类三阴( ER、P R、HER2均阴性)乳腺癌亚型中ID1是肺转移的调节者[14]。本研究发现ID1在胆囊癌的表达显著高于上皮内瘤变及炎症组织，提示其与胆囊腺癌的发生相关。

E2F1作为E2Fs转录因子家族的一员，调控DNA复制及细胞周期进程相关基因的表达[15]，过表达的E2F1促进细胞从G0/G1期进入S期，促进细胞增殖及恶性转化。国内外研究表明，E2F1在胃癌、乳腺浸润性导管、膀胱癌、淋巴瘤等多种恶性肿瘤中过表达[16-17]。本研究发现E2F1在胆囊腺癌的表达显著高于上皮内瘤变及炎症组织，提示E2F1与胆囊腺癌的发生相关。本研究结果显示E2F1和ID1均与临床分期显著相关，提示E2F1和ID1过表达与胆囊腺癌浸润、转移有关，对临床分期有重要指导意义。

本研究发现胆囊腺癌组织中，Bim分别与比较，负相关P<0.05，提示联合Bim、ID1和E2F1检测有助于胆囊癌的早期诊断。 生存分析提示Bim表达的患者生存率高于ID1和E2F1，提示联合检测Bim、ID1和E2F1有助于判断胆囊癌预后。

推测促凋亡因子Bim和ID1、E2F1之间存在拮抗关系；Bim通过促进细胞凋亡从而抑制癌症的发生发展，E2F1、ID1促进细胞增殖促进肿瘤组织的发生发展，三者之间存在某种制衡。

4 结论

Bim在胆囊癌中低表达，对胆囊癌癌细胞凋亡的调控能力减弱，导致肿瘤细胞克隆、增殖。ID1在胆囊癌中的表达显著高于上皮内瘤变及炎症组织，其过量表达促进胆囊癌细胞无限增殖。E2F1过表达与胆囊上皮细胞恶变及增殖相关，促进胆囊腺癌的发生。同时本研究显示E2F1和ID1过表达与胆囊腺癌浸润、转移有关。可见联合检测Bim、ID1和E2F1对胆囊癌早期诊断及判断预后具有重要的指导意义[18]。

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Expression and biological significance of Bim,ID1 and E2F1 in gallbladder cancer tissue

ZHU Jun1, ZHU Kexiang2, LI Xun2，3,etal

(1.DepartmentofPathology,DonggangSection,TheFirstHospitalofLanzhouUniversity,Lanzhou730000,China;2.DepartmentofSurgery2,TheFirstHospitalofLanzhouUniversity,Lanzhou730000,China;3.DepartmentofTumor,DonggangSection,TheFirstHospitalofLanzhouUniversity,Lanzhou730000,China)

Objective To investigate the expression and significance of Bim,ID1and E2F1 in gallbladder cancer tissue. Methods The application of tissue microarray technology and immunohistochemical method was used in 70 cases of the gallbladder cancer (group A), 20 cases of high level intraepithelial neoplasia (group B), 30 cases of low level intraepithelial neoplasia (group C) and 20 cases of cholecystitis tissues (group D). Results The positive expression rate of Bim in group A, B, C and D were 27.1%, 30%, 60% and 65% (P<0.05). The positive expression rate of ID1 in group A, B, C and D were 70%, 65%, 23.3% and 20% (P<0.05). The positive expression rate of E2F1 group A, B, C and D were 84.3%, 75%, 16.7% and 10% (P<0.05). Bim was negatively related to the gallbladder cancer differentiation degree (P<0.05), but not correlated with clinical Nevin stage (P>0.05). ID1 and E2F1were significantly correlated with clinical Nevin stage (P<0.05), but not correlated with the gallbladder cancer differentiation degree (P>0.05). Survival analysis show that the lifetime of Bim positive patient was significantly higher than that of ID1and E2F1 positive patients (P<0.05).Conclusion Bim, ID1 and E2F1 may play an important role in the generation and development of the gallbladder cancer. The joint detection of Bim, ID1 and E2F1 protein has some degree of guiding significance in early diagnosis and prognosis of the gallbladder cancer.

Gallbladder cancer; Bim; ID1; E2F1

国家自然科学基金(31270543)

李汛：教授，本刊副主编，E-mail：lxdr21@souhu.com

R 735.8

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.02.004

2015-06-18； 编辑： 张文秀)