李翠，杨世发，林树乾，李桂明，赵增成，黄中利，傅剑，宋敏训，冯敏燕**

（1.山东师范大学，山东 济南 250014；2.山东省农业科学院家禽研究所，山东 济南 250355）

鸭疫里默氏杆菌与大肠杆菌混合培养及重新分离方法初探*

李翠1，2，杨世发2，林树乾2，李桂明2，赵增成2，黄中利2，傅剑2，宋敏训2，冯敏燕2**

（1.山东师范大学，山东 济南 250014；2.山东省农业科学院家禽研究所，山东 济南 250355）

本文通过以不同比例及在不同时间接种鸭疫里黙氏杆菌和大肠杆菌，共同培养一段时间后用鉴别培养平板对共同培养物实施分离，从而建立了鸭疫里黙氏杆菌和大肠杆菌共同培养并重新分离的方法，为体外研究鸭疫里黙氏杆菌和大肠杆菌共同感染引起的家禽疾病的耐药性解决了技术难题。

鸭疫里默氏杆菌；大肠杆菌；混合培养；分离

鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer，RA）是引起鸭疫里默氏杆菌病（Riemerella anatipestifer infection）的病原菌。鸭疫里默氏杆菌病引起幼鸭急性或慢性败血性传染，是严重危害全世界养鸭业的一种主要疾病[1]。大肠杆菌是已报道造成家禽养殖业经济损失最严重的细菌病的病原体。临床上鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌常混合感染，两病均能使不同品种、日龄及性别的鸭感染发病，以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎和脑膜炎为特征性病理变化，临床诊断很难将两者区分开来，并且死亡率高，淘汰率高，对养鸭业造成极大经济损失[2，3]。随着抗生素的大量使用，两种菌的抗药性和耐药谱不断扩大。临床治疗虽然在药敏试验的基础上指导用药，然而往往实际治疗效果不佳，其原因很可能是因为这两种菌多混合感染，且拥有各自不同的耐药谱，抗药性发生了种间的水平传递，这就使得每种菌的抗药性都增加，抗菌谱更加扩大，导致治疗失败。为了研究鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌在体外混合培养条件下菌株间是否发生了耐药性水平传递，首先要共同培养这两种菌。因为RA和E.coli两种细菌的培养条件相差很大，体外共同培养时大肠杆菌具有生长优势，确定两种菌能共同生长并发生耐药性传递的培养条件并建立这两种细菌的体外共同培养及重新分离的方法，是要解决的一大技术难题。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验仪器 超净工作台、恒温振荡器、CO2培养箱、高压锅、电子天平、冰箱。

1.1.2 试验药物 药敏片均购自杭州天和微生物试剂有限公司。庆大霉素标准品购自中国药品生物制剂品检定所。

1.1.3 试验试剂 麦康凯琼脂、胰蛋白胨大豆琼脂、胰蛋白大豆肉汤培养基，均购自青岛高科园海博生物技术有限公司。麦康凯琼脂平板、含4%血清胰蛋白胨大豆琼脂平板、庆大霉素抗性平板按常规方法配制。

1.1.4 试验菌株 鸭疫里默氏杆菌P3菌株，由山东省农业科学院家禽研究所提供。大肠杆菌标准菌株8099，购自中国兽医药品监察所。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种复苏 取冻干保存的鸭疫里默氏杆菌P3菌株，取1ml生理盐水溶解混匀，将混合物接种于TSA平板（加4%血清），CO2培养箱37℃培养24h，挑取单个菌落接种于TSB培养基中（加4%血清），摇床培养24h。大肠杆菌标准株活化，同上[4]。1.2.2 药敏试验 采用药敏试纸片法 （k-B法），选取氨基糖苷类及喹诺酮两大类共9种抗生素按常规进行药敏试验[5]。RA P3菌株接种在含4%血清的 TSA平板上，置 CO2培养箱 37℃培养 16～20h；大肠杆菌8099菌株在普通琼脂平板上培养，置37℃恒温箱中培养16～18h。

1.2.3 药物最小抑菌浓度测定 采用试管双倍稀释法测定RA及大肠杆菌对庆大霉素的MIC[5]。

1.2.4 鸭疫里默氏杆菌与大肠杆菌混合培养与分离

1.2.4.1 大肠杆菌和RA以不同比例同时接种 将RA以5、10、20、40μl量分别接种于4ml含 4%血清的TSB培养基中，每管再接入5μl大肠杆菌混合，形成大肠杆菌和 RA以1:1、1:2、1:4、1:8不同比例接种量，37℃摇床振荡培养16～20h，增菌后的混合菌液用生理盐水稀释至 3×103CFU/ml和 6× 102CFU/ml，分别取100μl涂布麦康凯平板、含4%血清的TSA平板、庆大霉素抗性板（庆大霉素含量为10μg/ml），CO2培养箱37℃培养20h，观察结果，统计菌落个数。

1.2.4.2 大肠杆菌和RA以不同时间接种 先将5μl RA P3菌株接种于4ml含4%血清的TSB培养基中，37℃摇床培养 14～18h之间刚见浑浊时，将 5μl大肠杆菌接种于上述培养基中混合，37℃摇床振荡培养6、9、12、18h后，按上述方法稀释涂板，CO2培养箱37℃培养20h，观察结果，统计菌落个数。

2 结果

2.1 药敏试验 鸭疫里默氏杆菌P3菌株对庆大霉素、妥布霉素、卡那霉素、链霉素、阿米卡星、环丙沙星、左氟沙星均为耐药；大肠杆菌标准株均为敏感，结果见表 1。

表1 鸭疫里默氏杆菌与大肠杆菌对化学药物的敏感性（抑菌圈直径：mm）

2.2 药物最小抑菌浓度（MIC） 试管双倍稀释法测得大肠杆菌标准株8099对庆大霉素的MIC为5μg/ml，RA对庆大霉素的MIC为 40μg/ml，因此选取10μg/ml的庆大霉素制备抗性板。

2.3 鸭疫里默氏杆菌与大肠杆菌混合培养与分离

2.3.1 大肠杆菌和RA以不同比例同时接种 大肠杆菌和RA以不同比例同时接种，混合培养20h后，稀释涂板，培养20h后，均无鸭疫里默氏杆菌生长，只有大肠杆菌生长。结果见表2。

表2 混合菌液稀释度为3×103CFU/ml和6×102CFU/ml的菌落个数统计

2.3.2 大肠杆菌和RA以不同时间接种 混合培养 6、9、12h后鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌均生长，继续培养18h后混合菌液中只有大肠杆菌，无鸭疫里默氏杆菌生长，结果见表3。

表3 混合培养6h、9h、12h、18h后不同稀释度的菌落个数统计

3 小结与讨论

在临床上，鸭疫里默氏杆菌病和大肠杆菌病往往在同一个鸭群中混合感染，并且两者从临床症状与剖检病变上难以区分，给治疗造成一定困难。本文通过不同比例及不同时间接种对鸭疫里默氏杆菌与大肠杆菌进行体外混合培养，通过鉴别培养平板分离混合培养物来优选体外混合培养条件。

将大肠杆菌和RA以不同比例同时接种到含4%血清的TSB培养基中，混合培养16～20h后分离检测，皆无RA生长。这可能与这两种菌对营养成分要求不同有关，大肠杆菌对营养成分要求比较低，在普通营养琼脂上就可以生长旺盛，而鸭疫里默氏杆菌对营养成分及培养条件要求比较高，一般在血液琼脂或胰蛋白胨大豆琼脂上生长良好，对营养要求苛刻的菌株需在胰蛋白胨大豆琼脂中添加0.05%酵母提取物和4%新生牛血清，并且需要增加CO2浓度。同时接种时，大肠杆菌存在竞争优势，与RA进行营养竞争，迅速繁殖而造成RA无法增殖。

改变两种菌的接种时间，先将RA接种到含4%血清的TSB中，摇床培养刚见浑浊时再接入大肠杆菌，混合培养。混合培养6、9、12h后鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌均生长，而继续培养至18h后，因大肠杆菌的竞争优势混合菌液中只有大肠杆菌，无鸭疫里默氏杆菌生长。

因此，体外混合培养鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌时，可以先接种RA培养至刚见浑浊时再接种大肠杆菌，混合培养12h左右为宜。

本研究解决了大肠杆菌和鸭疫里黙氏杆菌共同培养的技术难题，为下一步研究大肠杆菌和鸭疫里黙氏杆菌的耐药性转移建立了基础。

[1] Y.M.Saif.禽病学[M].高福，索勋，译.第12版.北京：中国农业大学出版社，2012:893.

[2] 倪粒琼.鸭源大肠杆菌与鸭疫里默氏杆菌原生质体融合及其融合子研究 [D].雅安：四川农业大学，2011.

[3] 张大丙，郭玉璞.1999.北京地区鸭传染性浆膜炎的流行病学调查[J].中国预防兽医学报，21（4）:260～263.

[4] 杨灵芝.鸭疫里默氏杆菌的液体培养技术及免疫原性研究[D].泰安：山东农业大学，2008.

[5] 陈东科，孙长贵.实用临床微生物学检验与图谱[M].北京：人民卫生出版社，2011.1:767-775.

S858.324.4+3

B

1673-1085（2016）04-0006-03

2016-03-08

*项目支撑： 山东省青年自然科学基金（ZR2012CQ042）， 山 东 省 重 点 研 发 计 划（2015GNC113004），山东省现代农业产业技术体系项目资助（编号：SDAIT-13-011-01），山东省农业科学院家禽研究所基金（2014SJJ02）。

**通讯作者。