秦 鹏，谢 鹏，刘广宇，梁宏基，梁淑娃， 黄葵英　(广州市微生物研究所，广东广州 510663)



响应曲面法优化罗伊氏乳杆菌发酵培养基

秦 鹏，谢 鹏，刘广宇，梁宏基，梁淑娃*， 黄葵英(广州市微生物研究所，广东广州 510663)

摘要[目的]优化罗伊氏乳杆菌发酵培养基，提高该菌发酵活菌数。[方法]采用Plackett-Burman以及响应曲面法对罗伊氏乳杆菌发酵培养基进行研究，确定罗伊氏乳杆菌发酵培养基中显著影响发酵活菌数的因素，并通过响应曲面法进行优化，以确定最优发酵培养基组分。[结果]试验表明，所得二次回归模型达到极显著水平，无失拟因素存在。优化后的罗伊氏乳杆菌发酵培养基组成为：葡萄糖 3.09%、酵母粉4.19%、果蔬汁10.03%，在此条件下发酵液活菌数可以达到8.25×109 CFU/mL。[结论]研究证实了响应曲面法可用于优化提高罗伊氏乳杆菌发酵活菌数，为其工业化生产奠定了基础。

关键词罗伊氏乳酸菌；Plackett-Burman设计；响应曲面法

Optimization of Fermentation Medium ofLactobacillusreuteriby Response Surface Methodology

QIN Peng, XIE Peng, LIU Guang-yu, LIANG Shu-wa*et al

(Guangzhou Institute of Microbiology, Guangzhou, Guangdong 510663)

Abstract[Objective] To increase the viable count of submerged fermentation ofLactobacillusreuteri. [Method] Plackett-Burman design and response surface methodology were used to investigate the fermentation medium ofL.reuteri. Factors significantly affected the viable count ofL.reuteriwere detected in fermentation medium. Optimization was carried out by response surface method. The combination of optimal fermentation medium was detected. [Result] The second-order regression models reached extremely significant level without the lack of fit. The optimized culture medium was 3.09% glucose, 4.19% yeast extract powder and 10.03% fruit and vegetable juice. Under this condition, the viable count of fermentation broth was 8.25×109CFU/mL. [Conclusion] Response surface method is suitable for the enhancement of viable count ofL.reuterifermentation broth, and lays foundation for the industrialized production.

Key wordsLactobacillusreuteri; Plackett-Burman design；Response surface method

罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)是普遍存在于人类和大部分动物肠道中的益生菌，它可以代谢产生有机酸、双乙酰、过氧化氢、细菌素及类细菌素等物质[1-2]，不仅能够调节胃肠道健康，还具有增强免疫力、抗肿瘤、抗癌变及抗衰老等多种功能[3-4]。然而目前，较低的发酵水平制约了罗伊氏乳杆菌的进一步扩大应用。

响应面分析法(response surface methodology，RSM)是一种优化工艺条件的有效方法，中心组合设计(CCD)可用于确定试验因素及其交互作用对指标响应值的影响，精确表述因素和响应值之间的关系[5]。响应面分析法具有试验次数少、周期短，求得的回归方程精确度高等优点，可以研究几个因素的交互作用，是降低生产成本、优化培养条件的一种有效方法，近年来逐渐受到重视，并成功运用到农业、生物、食品等领域[6]。

笔者使用Plackett-Burman设计，对发酵培养基中影响发酵液活菌数的显著因子进行筛选；然后使用响应面分析法，对发酵培养基中的葡萄糖、酵母粉和果蔬汁3种显著影响发酵液活菌数的因素进行优化，以提高罗伊氏乳杆菌发酵液中的活菌数，为后续工业化扩大生产奠定理论基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种及原料。供试菌种为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)，广州市微生物研究所保藏；果蔬汁， 北京汇源食品饮料有限公司。

1.1.2培养基。种子培养基：蛋白胨 1.0%，牛肉膏 1.0%，酵母粉0.5%，葡萄糖 2.0%，磷酸氢二钾 0.2%，柠檬酸氢二铵 0.2%，乙酸钠 0.5%，硫酸镁 0.058%，pH 6.2～6.4。

发酵培养基：葡萄糖3.5%，酵母粉2.0%，果蔬汁10.0%，磷酸氢二钾 0.2%，柠檬酸氢二铵 0.2%，乙酸钠 1.0%，pH 6.0。

1.2培养方法将罗伊氏乳杆菌冻存保管，接种于种子培养基，37 ℃厌氧静置培养 18～24 h，待活菌数达 1×108CFU/mL时，按 2%接种量接种于发酵培养基，37 ℃厌氧培养 24 h 后，使用微生物计数方法，对发酵液计数。

1.3测定方法及计算采用稀释倒平板法，具体原理和步骤参考GB 4789-2010 中乳酸菌菌落总数的测定方法[7]。

1.4关键因素筛选试验使用Minitab软件，对发酵培养基的7个因素进行Plackett-Burman组合设计。每个变量设高低2个水平，响应值为发酵液活菌数(Y)，共进行12次试验，考察各个因素的主效应和交互效应的一级作用，从中筛选出对发酵液活菌数具有显著作用的3个因素。Plackett-Burman设计中各个因素水平及编码见表1。

1.5培养基优化根据Plackett-Burman试验的结果，选取葡萄糖、酵母粉和果蔬汁这3个因子作为研究对象，进行响应面试验，以发酵液活菌数(Y)作为试验的响应值，使用Design expert 7.5进行试验设计与数据分析。中心组合试验实际的因素水平以及编码见表2 。

2结果与分析

表1　Plackett-Burman设计因素水平及编码

表2　培养基参数水平编码

表3　Plackett-Burman试验以及试验结果

表4　Plackett-Burman试验方差分析

使用Design expert 7.5软件对数据进行分析，得到的编码方程为Y=6.970+1.354×A+0.915×B-0.272×C-0.005×A×B-0.005×A×C+0.245×B×C-0.619×A2-0.384×B2-0.512×C2。使用Design expert 7.5软件进行寻优，得到最优化条件为葡萄糖 3.09%、酵母粉4.19%、果蔬汁10.03%，此时预测的响应值(发酵液活菌数)可达8.25×109CFU/mL。

从以上分析可知，因素B(酵母粉)和C(果蔬汁)的交互作用对罗伊氏乳杆菌发酵液中的活菌数影响显著(P=0.000 4<0.05)。这说明在培养基中添加一定量的果蔬汁、酵母粉等富含氨基酸维生素的物质，可以促进罗伊氏乳杆菌的生长，这也从侧面说明了罗伊氏乳杆菌是异养菌，为使菌体增殖，获得更高的发酵活菌数，必须添加生长因子；但过量的营养物质会引起渗透压升高等不利因素，抑制菌体的增殖，并且造成资源的浪费。

表5　中心组合试验及结果

图1　酵母粉与果蔬汁的交互作用Fig.1　Interaction between yeast extract powder and the fruit and vegetable juice

图2　葡萄糖与酵母粉交互作用Fig.2　Interaction between glucose and yeast extract powder

由3组交互作用图(图1～3)可以看出，响应曲面呈伞形，中心突起，说明两因素之间的影响基本呈抛物线型关系，均有一个极大值点，变化趋势都是先增大后减小，即存在适宜的葡萄糖、酵母粉和果蔬汁的浓度使罗伊氏乳杆菌发酵液中的活菌数达到最高。

图3　葡萄糖与果蔬汁交互作用Fig.3　Interaction between glucose and the fruit and vegetable juice

2.3验证试验为验证预测值与真实值之间的拟合程度，使用上述优化条件在摇瓶水平上进行了重复验证试验：葡萄糖 3.09%、酵母粉4.19%、 果蔬汁10.03%，pH 6.0，试验共进行3组(详细结果见表6)，平均活菌数8.28×109CFU/mL，与预测值拟合性良好，较优化前提高28.40%。

表6　验证试验结果

3结论

罗伊氏乳杆菌是一种异型发酵乳酸菌，Doleyres 等分批培养罗伊氏菌获得生物量为 1.7×109CFU/mL[8]；国内学者王志林等对罗伊氏乳杆菌发酵过程参数进行了研究优化，获得的细胞密度达到了3.1×109CFU/mL[9]。

该研究以罗伊氏乳杆菌发酵过程中的活菌数为研究对象，使用Plackett-Burman对培养基中显著影响发酵液活菌数的因素进行快速筛选，然后通过响应曲面法对这些因素进行研究，建立了葡萄糖、酵母粉、果蔬汁这三者与活菌数之间的关系，并实现优化。最优条件为葡萄糖 3.09%、酵母粉4.19%、果蔬汁10.03%，pH 6.0，发酵活菌数预测值为8.25×109CFU/mL。通过验证试验证实该试验建立的模型具有实际指导意义，优化后罗伊氏乳杆菌发酵活菌数可达8.28×109CFU/mL，较优化前提高28.40%，且与模型预测值非常接

近，优于Doleyres等、王志林等的结果，可为罗伊氏乳杆菌发酵工艺的开发与优化提供研究基础。

参考文献

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[6] 曹小红，哈志瑞，王春玲，等.响应面法对BcalliusnattoTK-2产聚-γ-谷氨酸(γ-PGA)发酵培养基的优化[J ].食品与发酵工业，2008(1)：24-26.

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[8] DOLEYRES Y，BECK P，VOLLENWEIDER S，et al.Production of 3-hydroxypropionaldehyde using a two-step process withLactobacillusreuteri[J].Applied microbiology and biotechnology，2005，68：467-474.

[9] 王志林，陈庄，廖玲，等.猪源罗伊氏乳酸杆菌培养条件优化及其冻干保护剂筛选[J].广东农业科学，2012(19)：151-153.

中图分类号S 188+.4

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)06-091-03

收稿日期2016-02-14

作者简介秦鹏(1983- )，男，山东青岛人，工程师，硕士，从事发酵工程研究。*通讯作者，高级工程师，从事发酵工程研究。

基金项目广东省协同创新与平台环境建设专项项目(2015B0404-03004)。