李志海

(鄄城县人民医院，山东 鄄城　274600)



不同浓度葡萄糖对体外培养人成骨细胞活性的影响及意义*

李志海

(鄄城县人民医院，山东 鄄城274600)

摘要：目的观察不同浓度葡萄糖对体外培养的人成骨细胞的影响，探讨糖尿病致骨质疏松症可能的发病机制。方法将4种不同浓度葡萄糖(5.5，10，20，40 mmol/L)的培养基培养人成骨细胞，培养3~12 d。观察葡萄糖对细胞增殖、凋亡及对细胞分泌碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(BGP)能力的影响。结果在一定浓度范围内，葡萄糖浓度越高，细胞增殖越明显，细胞分泌ALP和BGP的能力下降，细胞凋亡率增加。结论高糖环境对人成骨细胞分泌能力有抑制作用。

关键词：葡萄糖；骨质疏松症；人成骨细胞；碱性磷酸酶；骨钙素

糖尿病可导致全身各系统发生变化。作为骨代谢的最终效应细胞之一的成骨细胞也因此受到影响。研究发现[1-4]糖尿病可影响动物成骨细胞活性，对人成骨细胞的研究较少。2008~2009年，我们根据糖尿病血糖升高的特点，观察不同浓度的葡萄糖对人成骨细胞的影响，探讨糖尿病导致骨质疏松的机制。

1材料与方法

1.1实验材料

人成骨细胞，取引产1 h内的7个月龄的胎儿骼骨松质骨，根据郑永志[5]等提供方法制备人成骨细胞。DMEM低糖型培养基、新生牛血清、50%葡萄糖注射液、胰酶、Ⅱ型胶原酶、噻唑蓝(MTT)、二甲亚砜(DMSO)、碱性磷酸酶(AKP)测定试剂盒、降钙素(BGP)检测试剂盒、FITC/PI凋亡检测试剂盒、倒置相差显微镜、流式细胞仪。

1.2实验分组

将制备第3代细胞按2×104/ml接种于96孔板，更换为含5.5(生理剂量，G0组)、10(G1组)、20(G2组)、40(G3组)mmol/L葡萄糖的培养基。G0组为生理对照组，G1～G3组为实验组。各组连续培养3～12 d时间。每孔设3个复孔。

1.3成骨细胞增殖、凋亡率及其ALP和BGP分泌能力的测定

各组分别在培养第3、6、9、12 d用MTT法检测细胞增殖情况，使用MTT检测数值表示细胞增值率的变化。Annexin-FITC/PI双染法检测细胞凋亡，以G0组细胞为对照设定十字门。用改良Gomori钙钻法及ALP检测试剂盒检测实验各组ALP活性。RIA法分别检测各组细胞分泌BGP活性。均严格按试剂盒说明书操作。

1.4统计学方法

用SPSS16.0，对所得数据进行方差分析和χ2检测。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1形态学观察

倒置显微镜下[1]：悬浮的单细胞呈折光性较高的球形。贴壁后，形态由球形变为多角形和鳞片状，均匀分布，胞突多而长，相互连接，胞质透明，颗粒少，单核较大，有2~3个核仁。可见到细胞分裂像。光镜下[2]：细胞分布较均匀稀疏，但有细胞密集区，细胞呈三角形，有较长的细胞间胞突，通过胞突细胞相互连接，胞质呈红色，胞核呈圆形或椭圆形，染色较深，可到细胞分裂像，在细胞密集处有深染的钙结节。

2.2不同浓度的葡萄糖对成骨细胞增殖的影响

在不同浓度葡萄糖作用下，第3，6，9，12 d细胞的增值率如表1所示。经统计分析显示，葡萄糖浓度升高能促进成骨细胞的增殖，G1组和G2组成骨细胞增值率较G0组明显升高(P<0.01)，但过高的葡萄糖浓度，即G3组对成骨细胞增值则无促进作用，其细胞增值率与G0组之间差异没有统计学意义(P=0.333)。

2.3各组细胞分泌ALP 、BGP的能力比较

经分析显示(表2)，G1组细胞分泌ALP的能力最强，明显高于其余3组(P<0.01)。其余3组细胞分泌ALP 的能力间没有明显差异。G0组BGP测定值最高，明显高于其他3组(P<0.05),但其余3组的BGP浓度间没有明显差异(P=0.544)。

表1　不同浓度葡萄糖作用下成骨细胞的增殖 ±s)

注：与G0组相比*P<0.01,**P=0.333

表2　不同浓度葡萄糖作用下成骨细胞分泌ALP 、BGP的测量结果

注：与其他各组比较*P<0.01，▲P<0.05。

2.4细胞凋亡率

实验组在第12d的早期凋亡率(LL)分别为5.13%，6.12%，8.01%，晚期凋亡率(UR)分别为：5.60%，10.44%，8.11%。

3讨论

骨质疏松，是破骨细胞和成骨细胞之间活性不平衡的结果。糖尿病易并发骨质疏松症已被公认，且动物实验表明在糖尿病大鼠病程早期即表现为成骨细胞数下降、破骨细胞数上升，说明骨形成减少，骨吸收相对大于骨形成[6]。但是体内实验可控制的因素太少，而影响因素较多，因此无法说明以血糖升高为特征的糖尿病对骨代谢的影响，也使得临床观察实验得到的结果差异很大[7-10]。为此，单纯的体外实验，就葡萄糖对骨形成的影响进行观察是非常必需的。在本研究中，我们设置了4种不同葡萄糖浓度的培养基，从细胞的增殖、分泌活性产物的能力、凋亡以及矿化能力各个方面观察了葡萄糖对体外培养的人成骨细胞的影响。

骨钙素(BGP)是成骨细胞合成和分泌的一种非胶原蛋白，主要沉积于骨基质中，其主要生理作用是维持骨的矿化速度，直接反映成骨细胞活性，是反映骨形成的指标[11]，可释放至血中，血清BGD水平与骨中BGD的含量呈正相关。我们采用RIA法测定了不同组别BGD分泌量，我们发现BGD分泌量在生理剂量组时最大，高于其他各组。随着葡萄糖浓度的升高，实验各组BGP分泌量没有明显差异。

通过研究，我们发现随着葡萄糖浓度升高，成骨细胞增殖率、凋亡率升高，但是浓度过高(40 mmol/l 对细胞增殖没有促进作用。ALP分泌能力在10 mmol/L时最强，而BGP分泌能力在5.51 mmol/L时最强。

总之，本研究表明，升高的葡萄糖浓度对细胞的增殖具有一定的促进作用，但增多的细胞数量并没有带来相应细胞活性的增加。相反，细胞分泌ALP和BGP的能力不同程度的出现了下降，且细胞凋亡比率增加。证实了高糖环境的毒性作用，特别是对细胞分泌能力的抑制。

参考文献：

[1]Balint E, Szabo P, Marshall CF, et al. Glucose-induced inhibition of in vitro bone mineralization[J].Bone,2001,28(1):21-28.

[2]苏友新，陈智能，杨连梓等.梯度糖溶液对体外培养成骨细胞影响的实验研究[J].中华骨伤，2005,19(7)：407-409.

[3]Majd Z, Sergiu B, Laura RM. P38 and activating transcriptionfactor-2 involvement in osteoblast osmotic response to elevated extracellular glucose[J]. J Biol Chem, 2002,277 (40):37212-37218.

[4]Zayzafoon M, Stell C, Irwin R, et al. Extracellular glucose influences osteobast differentiation and c-Jun expression[J].JCell Biochem,2000,79(2):301-310.

[5]郑志永， 杨久山， 毕荣修等， 人成骨细胞的离体培养和鉴定[J].中国医学工程，2006:8(14)：8-9.

[6]徐浩， Eichstaedt H. 肝移植术后骨质疏松症患者骨代谢的改变[J]. 中华器官移植杂志， 1999,20:248.

[7]Hanley DA, Brown JP, Tenenhouse A,et al. Associationsamong disease conditions, bone mineral density, and prevalentvertebral deformities in men and women 50 years of age andolder:cross-sectional results from the Canadian multicentreosteoporosis study[J].JBMR,2003,18(4):784-790.

[8]Akin O, Gol K,Akturk M,et al. Evaluation of bone turnoverin postmenopausal patients with type 2 diabetes mellitus usingbiochemical markers and bone mineral density measurements [J].Gynecol Endocrinol,2003, 17(1):19-29.

[9]Al-Maatouq MA, El-Desouki MI, Othman SA,et al. Prevalence of osteoporosis among postmenopausal females withdiabetes mellitus[J]. Saudi Med J,2004, 25(10):1423-1427.

[10]林华， 王新.糖尿病骨质疏松的研究进展[J].江苏医药， 1995 (10)：679-680.

[11]CROFTOM P M,WADE J C, TAYLOR M R H.Serum concentracim of carboxylterminal propeptide of type Ⅰ procollagen, a min-telopeptide of type Ⅲ procollagen, cross-linked arboxyl-terminal telopptide of Ⅰ collagen, andtheir interrelationships in school children[J].Clin Chen, 1997,43:1577-1581.

The influence of different glucose concentrattion on cellular activiity of human osteoblast cell

LIZhi-hai

(Juancheng People Hospital， Juancheng 274600，China)

Abstract:Objective: In this research ,we took an insight into the influence of different glucose concentrations on human Osteoblast cell, hoping to give an explanation to the mechanism of the osteoporosis (OP) caused by diabetes mellitus (DM). Methods： Four culture media of different glucose concentration (5.5 , 10, 20 or 40 mmol/L) were set up for this study . Human Osteoblast cell was cultured in these media successively for 3~12 d, and then the proliferation rate of cells, secretion of ALP and BGP, percentage of apoptosis cells were observed and measured .Results： within a certain glucose concentration, the elevated glucose concentration prompted the proliferation of Osteoblast cells, but the activities of Osteoblast cells were not correspondent with the cell number .On the contrary, the secretion of ALP and BGP of the Osteoblast cells were decreased .The apoptosis of the cells was promoted .Conclusion： From our study, we confirmed the hyperglycemia can inhibit the secretion ability of Osteoblast cells.

Key words:glucose; osteoporosis; human osteoblast Cell; ALP; BGP

(收稿日期2015-11-16)

doi:10.3969/j.issn.1004-7115.2016.02.005

中图分类号：R681

文献标识码：A

文章编号：1004-7115(2016)02-0133-03

*作者简介：李志海(1977—)，男，山东郓城人，主治医师，本科，主要从事临床骨科工作。