田晶　李雅　刁红亮　马瑞燕

摘 要：为了了解环境因子对玫烟色棒束孢分生孢子萌发的影响，采用凹玻片悬滴等方法研究了温度、湿度、光周期、初始pH值、紫外照射、高温胁迫及吐温-80浓度对玫烟色棒束孢IF-1106菌株孢子萌发的影响。结果表明：玫烟色棒束孢孢子萌发的最适温度为26 ℃左右，适温为23～32 ℃，玫烟色棒束孢分生孢子萌发对湿度的要求较高，低于85%分生孢子不萌发。黑暗促进孢子萌发，光照抑制孢子萌发，但光暗交替时，随着光照时间的延长，孢子萌发率升高。孢子萌发最适pH值为5～7，用0.05%～1%的吐温-80配制孢子悬浮液。经过48 ℃高温和紫外线照射处理后，玫烟色棒束孢孢子的萌发都受到很大程度的抑制。因此玫烟色棒束孢IF-1106菌株分生孢子萌发最适条件为温度26 ℃，相对湿度95%以上，初始pH值为6，全黑暗培养。

关键词：玫烟色棒束孢；环境因子；萌发率

中图分类号：Q935 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.04.002

Abstract： In order to understand the effects of environmental factors on conidia germination of Isaria fumosorosea1， concave glass hanging drop and other method were used to study the effects of temperature， humidity， photoperiod， initial pH value， short-time ultraviolet radiation， heat stress and the concentration of Tween-80 on the conidia germination of Isaria fumosorosea1 IF-1106. The results showed that the optimum temperature for conidial germination was 26 ℃， the range of suitable temperature was 23～32 ℃， and the conidia germinated at a high relative humidity， when RH lowers than 85%，the conidia were ungerminative. The conidia germination rate was high under the dark， and the conidia germination rate was low under the light. Under the condition of alternating light and dark， the rate has a trend of growing with the longer light time. And the optimal pH was 5～7， 0.05%～1% Tween-80 was used to prepare the suspension. With the treatment of heat stress and short-time ultraviolet radiation， the strong inhibition in conidia germination of Isaria fumosorosea1 was exhibited. So the best condition for conidia germination was 26 ℃，RH higher than 95%， pH6 and dark.

Key words： Isaria fumosorosea1； environmental factors； conidia germination rates

玫烟色棒束孢（Isaria fumosorosea）旧称玫烟色拟青霉（Paecilomyces fumosoroseus），是一类重要的昆虫病原真菌。该菌地理分布广泛，因此寄主多样，尤其对蚜虫、粉虱等刺吸式口器害虫有很强的致病力[1-2]。

笔者在田间分离到1株玫烟色棒束孢，命名为IF-1106菌株，该菌株可以侵染烟粉虱所有虫态，其中对烟粉虱2龄若虫的致病力最高，因此可以做为防治烟粉虱的高效菌株[3-4]。分生孢子是病原真菌侵染寄主的基本单位，其感染寄主的关键是分生孢子能否成功附着在寄主表面并萌发[5]。昆虫病原真菌在其应用中会受到一定的环境条件如温度、湿度的影响[6]，因此，掌握影响该玫烟色棒束孢菌株孢子萌发的环境因子，是进一步利用该菌防治害虫的基础。为了解该菌株的分生孢子萌发特性，对该菌株在不同温度、湿度、光周期、初始pH值、紫外线照射时间、高温胁迫时间及吐温-80浓度条件下菌株孢子萌发情况进行了研究，旨在明确玫烟色棒束孢的大田应用前景。

1材料和方法

1.1 供试菌株

供试菌株为玫烟色棒束孢（Isaria fumosorosea）IF-1106菌株，保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1.2 玫烟色棒束孢菌株分生孢子悬浮液的制备

将玫烟色棒束孢IF-1106菌株接种在PDA培养基上，在25 ℃条件下培养10 d，用灭菌过的盖玻片刮取孢子，加入适量的无菌水，用磁力搅拌器搅拌30 min，用四层纱布过滤掉菌丝。显微镜下用血球计数板计数，将孢子悬浮液浓度控制在显微镜（10×40）下每个视野有50个孢子左右，以下试验均用此浓度的孢子悬浮液。

1.3 不同温度下孢子萌发率测定

采用凹玻片悬滴法[6]，将孢子悬浮液加入到萌发液（2%葡萄糖，0.5%蛋白胨）中，将配好的孢子悬浮液分别置于10，15，20，23，26、29，32，35 ℃共8个温度下培养24 h后镜检孢子萌发率，每个处理重复6次，以芽管长度超过孢子直径一半作为萌发标准[6]。

1.4 不同湿度下孢子萌发率测定

采用饱和盐控制空气相对湿度[7]，将配好的孢子悬浮液滴在灭菌的载玻片上，将载玻片置于直径为9 cm的灭菌的玻璃培养皿中，并在培养皿中放入直径5 cm的塑料培养皿，在小培养皿中分别加入葡萄糖、亚硝酸钠、氯化钠、氯化钾、硫酸钾的饱和盐溶液控制湿度，使相对湿度分别为55%，65%，75%，85%，95%，每个处理重复6次，24 h镜检孢子萌发率。

1.5 不同光周期下孢子萌发率测定

采用凹玻片悬滴法，设24 L、16 L/8 D、14 L/10 D、12 L/12 D、10 L/14 D、8 L/16 D、24 D七个光周期25 ℃下培养24 h后检测孢子萌发情况，以计算孢子萌发率及萌发速度，每个处理6次重复。

1.6 不同初始酸碱度对分生孢子萌发的影响

采用凹玻片悬滴法，用NaOH和乳酸调节孢子悬浮液pH值分别为3，4，5，6，7，8，9，10，然后25 ℃条件下培养24 h后检查孢子萌发情况，每个处理6次重复。

1.7 紫外线照射对孢子萌发的影响

取5 mL分生孢子悬浮液，在无菌室内功率为30 W紫外灯正下方50 cm处的磁力搅拌器上振荡照射，每隔1 min用移液器抽取液体，设置照射时间1，2，3，4，5和6 min，共6个处理，另外设不照射为对照组。紫外照射处理后，按5%的比例接入到装有10 mL萌发液的试管中，在温度为25 ℃，摇床转速为150 r·min-1条件下振荡培养，24 h后镜检萌发率。

1.8 高温处理对孢子萌发的影响

参照孢子水浴胁迫法[6， 8]，移取0.1 mL孢子悬液于装有1 mL孢子萌发液的10 mL试管中，振荡混匀。然后将玻璃管放在48±0.5 ℃的水浴锅中分别水浴加热3，6，9，12，15，30 min后，在相对湿度100%、温度25 ℃、150 r·min-1的条件下做萌发实验，每个处理重复6次，以未经水浴加热的孢子作为对照。24 h后镜检萌发率。

1.9 吐温-80不同浓度对孢子萌发的影响

用含1%，0.5%，0.1%，0.05%，0.01%吐温-80无菌水，将孢子洗下并配成孢子悬浮液，采用凹玻片悬滴法，在25 ℃条件下培养，24 h后镜检萌发率。

1.10 数据处理

用SPSS17.0数据处理系统对实验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 温度对分生孢子萌发的影响

由试验结果（图1）可以看出，温度对玫烟色棒束孢孢子萌发的影响显著（F=636.51； df=7，40； P<0.001）。该菌株在26 ℃的温度下孢子萌发率最高，为95.89%。高于或低于26 ℃，孢子萌发率都有所下降，在温度为23 ℃和32 ℃时孢子萌发率都高于80%。表明该菌孢子萌发的最适温度为26 ℃左右，在23～32 ℃的温度范围内孢子都能较好的萌发。高温和低温都不利于该菌孢子的萌发。

2.2 湿度对分生孢子萌发的影响

试验结果表明，该菌株分生孢子在空气相对湿度低于85%时几乎不萌发。当空气相对湿度在85%以上时，随着空气相对湿度的增加，分生孢子萌发率也不断升高。在空气相对湿度为85%时，孢子萌发率为83.94%。在空气相对湿度95%时萌发率最佳，萌发率可达到93.19%。

2.3 光周期对分生孢子萌发的影响

菌株在不同光周期条件下，孢子有不同程度的萌发，差异显著（F=175.33； df=6，35； P<0.001）。全黑暗条件下（24 D），分生孢子的萌发率最高，达到90.03%，而在全光照条件下（24 L），分生孢子的萌发率最低，为52.69%。在光暗交替的环境中，随着光照时间的延长，孢子萌发率呈上升趋势（图2）。

2.4 初始pH值对分生孢子萌发的影响

初始pH值在4～10范围内，玫烟色棒束孢IF-1106菌株均能产孢（图3），相互间差异显著（F=387.22； df=6，30； P<0.001）。菌株pH值为6时萌发率最高，可达到90%以上；pH值为5和7时，孢子萌发率也能达到85%左右，并且两者之间差异不显著。在pH值为中性偏微酸性（pH值为5～7）的环境比偏酸性（pH值为4）或偏碱性（pH值为8～10）的环境更适于其萌发。在pH值为4，9和10时，萌发率均较低，低于50%。偏酸性或偏碱性条件均不适宜该菌株孢子的萌发，该菌株的最适pH值范围为5～7。

2.5 紫外照射对分生孢子萌发的影响

本研究结果表明，紫外照射对玫烟色棒束孢IF-1106菌株分生孢子的萌发有很大的影响，且相互间差异显著（F=577.31； df=6，35； P<0.001）。当玫烟色棒束孢经紫外线照射1 min，萌发率为75.59%，比对照下降7.99%。随着照射时间的延长，孢子萌发率呈明显的下降趋势，当紫外线照射时间延长至6 min时，孢子萌发率仅有10.94%，比对照下降72.64%（图4）。

2.6 高温胁迫对分生孢子萌发的影响

在高温48 ℃处理3 min条件下，IF-1106菌株的孢子萌发率为42.18%，比对照下降47.54%。在高温胁迫处理15 min后，孢子萌发率已低于10%；在高温胁迫处理30 min后，孢子萌发率仅有4.16%（图5）。随着高温胁迫处理时间的增加，菌株孢子萌发率呈下降趋势。

2.7 吐温-80浓度对分生孢子萌发的影响

在不同浓度吐温-80溶液条件下，IF-1106菌株分生孢子萌发率均在80%左右，相互间差异不显著（F=0.23； df=5，30；P=0.947）。试验结果表明，吐温-80浓度对分生孢子萌发基本无影响。

3 结论与讨论

3.1 温度的影响

据报道，玫烟色拟青霉菌丝生长适温为8～32 ℃，最适温度为25～28 ℃，高温30～40 ℃比低温6～11 ℃对生长的影响更大 [9-10]。张仙红等[11]的研究表明玫烟色拟青霉分生孢子萌发的最适温度为20～28 ℃。Lacey等[12]研究表明玫烟色棒束孢菌丝生长最适合温度为24～28 ℃，本试验研究表明26 ℃条件下，玫烟色棒束孢IF-1106菌株的孢子萌发率达到最大值。26 ℃是玫烟色棒束孢IF-1106菌株孢子萌发的最适温度。20 ℃以下或32 ℃以上，孢子萌发率显著降低，可见低、高温条件均不利于该菌株孢子萌发。

3.2 湿度的影响

有研究指出，在25 ℃温度条件下，当空气相对湿度为100%时，孢子萌发率达到72.2%，当空气相对湿度为90%时，孢子萌发率下降到38.1%，当空气相对湿度低于85%时孢子几乎不萌发[11]。本试验结果表明，空气相对湿度低于85%，孢子几乎不萌发。空气相对湿度85%以上，随着空气相对湿度的增加，分生孢子萌发率不断升高，在空气相对湿度95%时，孢子萌发率最佳。这表明分生孢子萌发要求较高的湿度条件，湿度越高萌发率越高。因此，高湿是分生孢子萌发的必要条件。

3.3 光周期的影响

有研究表明在全光照24 L条件下，菌落生长最快且产孢量最大，随光照时间的缩短菌落生长减慢且产孢量降低[13]。本研究结果表明：光暗交替比全光照24 L条件下孢子萌发率高，比全黑暗24 D条件下孢子萌发率低。与前人的研究结果不太一致，这可能是由于玫烟色棒束孢不同菌株之间对光照需求各异所产生的差异。

3.4 紫外照射的影响

随着照射时间的延长，孢子萌发率呈明显的下降趋势。张晓敏等[14]针对紫外辐射对球孢白僵菌的影响，对光保护剂对孢子萌发的影响进行了研究。结果表明，进行紫外保护剂的添加能提高菌株抗紫外杀伤力的作用。本菌株在短时间的紫外照射条件下萌发率很低，由此表明紫外照射对IF-1106菌株孢子的杀伤力较强，本菌株不耐紫外照射。大田施用时，要尽量避免强紫外光线天气或者添加紫外保护剂。

3.5 高温胁迫的影响

随着高温胁迫处理时间的增加，菌株孢子萌发率不断下降。该菌株对高温的耐受力较弱，在田间应用时要注意尽量避开高温天气，在温度相对较低的情况下进行，以免影响其施用防效。

综上所述，玫烟色棒束孢IF-1106菌株培养最适温度26 ℃，相对湿度95%以上，全黑暗24 D条件培养，初始pH值弱酸性（pH值为6）。紫外线照射和高温胁迫对玫烟色棒束孢IF-1106菌株的影响较大，表明本菌株不耐紫外线照射，不耐高温。

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