李涛

(曲靖市第一人民医院肿瘤科，云南 曲靖　655000)



小白菊内酯诱导人膀胱癌细胞BIU-87凋亡作用的机制探讨

李涛

(曲靖市第一人民医院肿瘤科，云南 曲靖655000)

摘要目的：研究小白菊内酯对人膀胱癌细胞BIU-87增殖与凋亡的影响及其机制。方法：采用不同浓度(15、30、60 μmol·L(-1))小白菊内酯孵育人膀胱癌细胞BIU-87后，用MTT法检测小白菊内酯对BIU-87细胞的增殖影响，流式细胞术检测小白菊内酯对BIU-87细胞凋亡率的影响，RT-PCR检测小白菊内酯作用BIU-87细胞后的bcl-2、bax mRNA表达情况。结果：经小白菊内酯作用后，MTT结果显示BIU-87细胞的增殖受到显著抑制，流式细胞术结果表明BIU-87细胞凋亡率显著上升(P<0.05)，RT-PCR结果表明BIU-87细胞bcl-2 mRNA表达水平降低(P<0.05)、bax mRNA表达水平增高(P<0.05)。结论：小白菊内酯通过诱导凋亡能抑制人膀胱癌细胞BIU-87的增殖，其机制可能与其下调bcl-2 mRNA和上调bax mRNA表达有关。

关键词：小白菊内酯；BIU-87细胞；凋亡；Bcl-2；Bax

膀胱癌是我国泌尿系统发病率最高的肿瘤[1]，近10年来，伴随烟草消费、工业化水平增加及人口老龄化，中国人膀胱癌发病率不论是男性还是女性，也不论在城市或农村，均呈现逐年增长趋势[2]。目前该病治疗以手术和化疗为主，但研究表明单纯手术切除后，膀胱癌复发率高达57%~75%，而化疗药物对膀胱癌细胞靶向杀伤性不强，毒副作用大，且容易产生不同程度的多药耐药(Multidrug resistance，MDR)[3]。小白菊内酯(Parthenolide，PN)是倍半萜烯内酯的主要成分，传统上主要用来治疗偏头痛、发热和类风湿性关节炎等[4]。近年来研究发现小白菊内酯可通过多种机制对多种肿瘤发挥抗癌重要作用，成为抗肿瘤药物研究的热点之一[5]。本文通过研究不同浓度小白菊内酯作用人膀胱癌BIU-87细胞株后对细胞增殖、凋亡产生的影响和BIU-87细胞bcl-2、bax mRNA表达水平的变化，进一步探讨其作用机制。

1材料与方法

1.1材料

BIU-87细胞株(中科院上海细胞生物研究所)，小白菊内酯、MTT试剂、二甲基亚砜(美国Sigma公司)，细胞培养基RPMI1640、胎牛血清(美国HyClone公司)，酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)，V-FITC凋亡检测试剂盒(上海碧云天研究所)，流式细胞仪(美国Couler公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养

BIU-87细胞使用含10%胎牛血清(FBS)和100 U·ml-1青霉素、100 U·ml-1链霉素的RPMI-1640培养基，置于含5%CO2的37℃恒温箱内培养。

1.2.2药物配制

小白菊内酯用二甲基亚砜(DMSO)溶液配制成浓度100 mmol·L-1的药液， 4℃冰箱避光保存。

1.2.3MTT法检测BIU-87细胞增殖活性

收集对数生长期BIU-87细胞，消化、计数并按5×103个·孔-1细胞接种于96孔板中，每孔加入100 μl细胞悬液，待细胞贴壁后，向实验组加入含不同浓度小白菊内酯的RPMI-1640完全培养基100 μl，使得实验组小白菊内酯的终浓度分别为15、30、60 μmol·L-1，另设对照组(加入同体积不含小白菊内酯的完全培养基)，每组设5个副孔。分别使药物孵育细胞24、48、72 h后弃上清，以MTT法测每组的吸光值(A490)，实验独立重复3次。

1.2.4流式细胞术检测BIU-87细胞凋亡率

对数生长期的BIU-87细胞经消化后，调整细胞浓度，按1×106个·孔-1细胞的密度接种于6孔板中。待细胞完全贴壁后，分别加入不同浓度药液使得小白菊内酯终浓度为15、30、60 μmol·L-1。另设对照组(加入等体积完全培养基)，每组设5个副孔。培养48 h后收集各组细胞，以4℃的PBS溶液洗涤3次后，用Annexin V-FITC及碘化丙啶(PI)(50 μg·ml-1)室温避光染色15 min，用流式细胞仪检测BIU-87细胞的凋亡情况。

1.2.5Real-time PCR检测BIU-87细胞Bax、Bcl-2 mRNA表达

用15、30、60 μmol·L-1浓度的小白菊内酯孵育BIU-87细胞48 h后，用Trizol法提取BIU-87细胞的总RNA，之后参照逆转录试剂盒说明逆转录为cDNA。再以cDNA为模板，采用Real-time PCR检测bcl-2、bax mRNA的表达水平，结果以β-actin为内参，bax/β-actin 、Bcl-2/β-actin密度比值显示。PCR引物序列：β-actin(416 bp)上游引物：5′-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3′，下游引物：5′-CCTAGAAGCATTTGCGGTGG-3′；bcl-2(234 bp)上游引物：5′-GGATTGTGGCCTTCTTTGAG-3′，下游引物：5′-CCAAACTGAGCAGAGTCTTC-3′；bax(169 bp)上游引物：5′-TGCTTCAGGGTTTCATCCAG-3′，下游引物：5′-GGCGGCAATCATCCTCTG-3′。 反应条件：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 16 s，60℃ 55 s，共进行40个循环。

1.3统计学分析

2结果

2.1小白菊内酯抑制BIU-87细胞增殖活性

MTT实验显示：与对照组比较，小白菊内酯组BIU-87细胞增殖活性均受到明显抑制，且抑制程度随小白菊内酯浓度增加和作用时间延长而增强，呈量效和时效关系，见图1。

图1　不同浓度小白菊内酯孵育BIU-87细胞24、48、72 h后抑制增殖情况

2.2小白菊内酯诱导BIU-87细胞凋亡

实验组细胞经不同浓度小白菊内酯孵育48 h后，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，结果显示：小白菊内酯组(15～60 μmol·L-1)BIU-87细胞发生不同程度的凋亡，与对照组细胞相比凋亡率均明显升高，且随药物浓度的增加，凋亡率明显递增(P<0.05)，呈剂量依赖性凋亡，见图2。

图2　不同浓度小白菊内酯孵育BIU-87细胞48 h后细胞凋亡情况注：与对照组比较，*P<0.05

2.3小白菊内酯下调bcl-2 mRNA、上调bax mRNA表达

小白菊内酯孵育BIU-87细胞48 h后采用Real-time PCR检测显示：与对照组相比，小白菊内酯组(15～60 μmol·L-1)BIU-87细胞bcl-2 mRNA表达水平随药物浓度增加明显降低(见图3A)，bax mRNA表达水平随药物浓度增高明显上升(见图3B)，两者都呈现剂量依赖性，各实验组间差异具有统计学意义(P<0.01)。

(A)

(B)图3　(A)不同浓度小白菊内酯孵育BIU-87细胞48 h后bax/β-actin的比值;　(B)不同浓度小白菊内酯孵育BIU-87细胞48 h后bcl-2/β-actin的比值注：与对照组比较，*P<0.05

3讨论

现今膀胱癌的病因仍在研究中，生长因子、细胞因子以及激素等生物活性物质参与了膀胱细胞癌变以及转移的过程，这些活性物质介导的信号转导途径发生异常，可引起某些基因的过度扩增, 导致正常细胞接受了异常的增殖、分化和生长信号，最终促使细胞发生癌变[6,7]，因此，在细胞中存在多条与膀胱癌发生发展相关的信号转导通路，如果能干扰其相关通路或可达到抑制肿瘤目的。植物来源的小白菊内酯近年来被发现具有较强的抗肿瘤活性，在体外可抑制多种肿瘤细胞株的生长增殖，并诱导其凋亡，比如肝癌、胆管癌及多发性骨髓瘤等[8-10]，本实验以膀胱癌细胞BIU-87为模型，观察小白菊内酯对BIU-87的凋亡作用及初步探讨其抗肿瘤机制。

MTT法是一种灵敏度高、操作简便、重复性好的细胞活性检测方法。本实验用来检测经小白菊内酯孵育后的BIU-87细胞增殖活性，发现随着药物作用浓度升高和时间增加，细胞增殖活性随之明显降低。同时流式细胞仪分析提示小白菊内酯处理组BIU-87细胞发生了不同程度的凋亡现象，药物浓度越高细胞凋亡率越高，呈剂量依赖性关系，这与MTT实验结果相符，因此我们推测小白菊内酯抑制细胞增殖活性与诱导细胞凋亡相关。

细胞凋亡的调控失常是引发肿瘤发生的重要因素，现有研究表明线粒体通路是调控细胞凋亡的主要通路[11]，而bcl-2家族参与控制线粒体释放凋亡因子[12]。Bc1-2和bax都属于bc1-2家族[13]，BC1-2编码蛋白抑制凋亡，BAX编码蛋白促进凋亡[14]。因此，下调bcl-2 mRNA表达可使细胞易于凋亡，上调bax mRNA表达可促进细胞凋亡。本实验中，Real-time PCR结果显示随着药物浓度增加，BIU-87细胞bcl-2 mRNA的表达明显下降，bax mRNA的表达明显升高，表明小白菊内酯是通过下调bcl-2 mRNA表达及上调bax mRNA表达诱导膀胱癌细胞BIU-87的凋亡。

4结论

根据实验结果我们得出结论：小白菊内酯对膀胱癌BIU-87细胞的增殖活性起明显抑制作用，其机制可能与其诱导BIU-87细胞凋亡及下调bcl-2 mRNA和上调bax mRNA的表达相关，其诱导肿瘤细胞凋亡的具体机制还有待进一步研究。

参考文献

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Study on mechanism of parthenolide induced apoptosis in human bladder cancer cells BIU-87

Li Tao

(Department of Oncology, The First People Hospital of Qujing, Yunnan Qujing 655000)

AbstractObjective：To investigate the effects and the possible mechanism of parthenolide on the proliferation and apoptosis of BIU-87 cells. Methods: Human bladder cancer cells BIU-87 were treated by parthenolide in different concentrations (0, 10, 20 and 40 μmol·L-1). MTT assay was applied to determine the effect of parthenolide on proliferation of BIU-87 cells, while apoptosis was analyzed by flow cytometry. Next, the mRNA levels of bcl-2 and bax in BIU-87 cells were analyzed by RT-PCR. Results: After parthenolide treatment, parthenolide could inhibit the growth and proliferation of BIU-87 cells, with increased apoptotic rates by flow cytometry(P<0.05). The results from RT-PCR suggested that parthenolide treatment contributed to the reduced bcl-2 mRNA level and the elevated bax mRNA expression in BIU-87 cells(P<0.05). Conclusions: Parthenolide could significantly inhibit the proliferation of human bladder cancer cells BIU-87 by induction of apoptosis, which may be associated with inhibiting bcl-2 mRNA expression and activating bax mRNA expression.

Key Words:Parthenolide; BIU-87; Apoptosis; Bcl-2 mRNA; Bax mRNA

(收稿日期：2015-12-8)

作者简介：李涛，男，主治医师，主要从事肿瘤药理研究，Email：yndq120@163.com。