陈珺汝　夏洪波　庄雪芬　郭锦锦　唐艳丽 　姚新生　孙万邦

(深圳市龙岗区妇幼保健院儿童保健科，深圳518172)



儿童新甲型流感疫苗远期特异性CD8+记忆T细胞的表型特征①

陈珺汝夏洪波庄雪芬郭锦锦②唐艳丽②姚新生②孙万邦②

(深圳市龙岗区妇幼保健院儿童保健科，深圳518172)

[摘要]目的：探讨儿童新甲型(H1N1)流感疫苗接种后远期外周血疫苗特异性CD8+记忆T细胞的特征。方法：选择31例于2009年12月～2010年1月接种甲型H1N1流感疫苗的3～6岁儿童，抽取外周静脉血5 ml，分离淋巴细胞加入甲型H1N1流感疫苗进行培养，并设对照组，用流式细胞仪检测细胞表面分子的表达，同时以CCK-8法检测细胞增殖，计算细胞增殖指数。结果：外周血PBMC中CD8+T细胞在实验组和对照组分别是13.41%与9.41%，P>0.05。CD8+初始T细胞在两组的比例均高达80%上；CD8+记忆T细胞在两组占17%～19%；记忆T细胞分中央型和效应型记忆T细胞，两个亚群检测结果：CCR7和CD62L单阳性记忆T细胞亚群在实验组占比明显低于对照组的占比，P<0.05。应用CCK-8法检测疫苗刺激后抗原特异性增殖，检测结果见细胞增殖指数大于0.8的仅为51.16%，大于1.0在本研究中没有。结论：31例儿童外周血PBMC中CD8+T细胞占比少，初始T细胞CD45R+均较高，具有抗原再刺激后再应答的基础；甲型H1N1流感疫苗可以诱导抗原特异性记忆CD8+T细胞的产生，但数量不多，其中大多数为中央型记忆CD8+T细胞；细胞增殖指数结果表明疫苗特异性细胞增殖不佳；提示对该疫苗的远期疫苗特异性CD8+T细胞免疫记忆不理想。

[关键词]儿童;新甲型(H1N1)流感疫苗;记忆T细胞;远期免疫;免疫记忆

甲型H1N1流感，是一种急性呼吸道传染病，其病原体是一种变异的新型甲型H1N1流感病毒，2009年自墨西哥甲型H1N1流感爆发以来，全球范围内确诊病例增长迅速，预防甲型H1N1流感最经济最有效的办法就是接种疫苗，当年我国首先研制H1N1疫苗控制大流行的有效措施进行免疫接种，其疫苗应用强度大、范围广，有关此疫苗的免疫原性和免疫持久性仅有抗体检测的少量报道，远期的免疫效果与特异性初始及记忆CD8+T细胞国内外缺少报道，本文就其疫苗特异性CD8+记忆T细胞进行研究，以期为H1N1疫苗远期免疫效果、新疫苗制备和接种策略提供综合评价与指导。

1材料与方法

1.1主要试剂CD8+T细胞FCM试剂：Amti-HU-CD4FITC、Amti-HU-CD8FITC、Amti-HU-CD62L PE、Amti-HU-CD45RO APC、Amti-HU-CD45RA APC-H7、Amti-HU-CD4 NHP PERCP 、Amti-HU-CD8 NHP PERCP及Amti-HU-(CD197)lCCR7 PE-CY7等试剂盒均购自美国Becton Dickinson公司，甲型H1N1流感疫苗(国药准字S20053091) 购自大连雅立峰生物制药有限公司，改良型RPMI1640培养液及胎牛血清购自ThermoFisher生物化学制品(北京)有限公司，CO2培养箱，美国SHEL公司；八色FACS Calibu r流式细胞检测仪，美国Becton Dickinson 公司，细胞增殖检测试剂盒(CCK-8)购自日本同仁化学研究所。

1.2对象按自愿原则选择2009年12月～2010年1月在深圳市龙岗区妇幼保健院接种新甲型H1N1流感疫苗的3～6岁儿童为研究对象31例，接种疫苗均3～4年。

1.3标本无菌采31例接种新甲型流感疫苗的儿童静脉血3 ml于抗凝管中，轻轻摇动试管，混匀，5 min后加入等量D′Hank′s液，手动轻轻摇匀。分离淋巴细胞 取淋巴细胞分离液2 ml于灭菌离心管内。离心、洗涤淋巴细胞，加RPMI1640培养液2 ml离心后弃上清，留沉淀细胞，调整淋巴细胞浓度(细胞数1×106ml-1)。

1.4淋巴细胞体外培养分组 将PBMCs 1×106ml-1培养在96孔培养板中，每孔100 μl，实验组加入新甲型H1N1流感疫苗(浓度3.0 μg/ml)，每组设3个复孔；对照组细胞不加新甲型H1N1流感疫苗，每孔加10%FCS-RPMI1640培养液100 μl，置5% CO2培养箱中37℃培养50 h。

1.5检测细胞表面分子取100 μl培养细胞于试管中，分别加入抗人CD4-FITC、CD8-FITC 等6种单克隆荧光抗体各10 μl。加入溶血素2 ml溶解红细胞，处理后加入固定液300 μl重悬细胞，BD-FACBCalibur流式细胞分析仪检测细胞表面分子：CD4/CD8、CD45RA、CD45RO、CD62L、CCR7。

1.6细胞增殖实验实验组与对照组置5% CO2培养箱中37℃培养50 h后，分别每标本取100 μl加入96孔培养板，细胞数为1×105ml-1；向每孔加入10 μl CCK-8试剂，继续培养1 h。比色(测定)：用酶联免疫检测仪检测各孔吸光度(A值，测定波长λ=570 nm，参考波长λ=620 nm)计算细胞增殖指数，了解记忆细胞疫苗特异性增殖反应。

1.7分组本研究根据同组实验检测31例儿童外周血新甲型H1N1流感抗体的高低水平，将31例研究对象分高应答组(12例)、应答组(12例)和低应答组(7例)。

1.8统计学分析数据分析采用SPSS 16.0 版软件，所有数据结果均以χ2表示，差异显著性采用方差分析检验，组间两两比较采用q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1H1N1疫苗接种儿童CD8+T细胞检测结果 特异疫苗刺激的实验组与对照组外周血PBMC中CD8+T细胞分别为13.41%与9.41%，两组比较经统计学处理无明显差异(P>0.05)，见图1。

图1　流感疫苗接种儿童CD8+T细胞检测结果Fig.1　Detection results of CD8+T cell after immunization with H1N1 influenza vaccine for children

图2　流感疫苗接种儿童CD8+CD45RA+初始T细胞检测结果Fig.2　Detection results of CD8+CD45RA+naive T cell after immunization with H1N1 influenza vaccine for children

图3　流感疫苗接种儿童CD8+CD45RO+记忆T细胞检测结果Fig.3　Detection results of CD8+CD45RO+ memory T cell after immunization with H1N1 influenza vaccine for children

图4　流感疫苗接种儿童CD8+CD45RO+记忆T细胞亚群检测结果Fig.4　Detection results of single positive CD8+memory T cell after immunization with H1N1 influenza vaccine for childrenNote: ▲.P<0.05，vs CCR7 of experimental group，#.P<0.05，vs CD62L of experimental group.

2.2H1N1疫苗接种儿童CD8+CD45RA+初始T细胞检测结果根据CD45RA/CD45RO的表达与否，CD8+CD45RA+CD45RO-细胞为CD8+初始T细胞；CD8+初始T细胞检查结果(见图2)，CD8+初始T细胞在实验组与对照组均高达80%以上，P>0.05。同时按ELISA法抗体水平≥200 μg/L为高应答组，≤100 μg/L为低应答组，介于二者间为中应答组，高中低三组比较，三组间差异无统计学意义，P>0.05。

2.3H1N1疫苗接种儿童CD8+CD45RO+记忆T细胞检测结果根据CD45RO的表达与否，可将CD8+T细胞分为CD8+CD45RO+和CD8+CD45RO-两个细胞亚群，CD8+CD45RO+细胞为CD8+记忆T细胞；CD8+记忆T细胞检测结果(见图3)：CD8+记忆T细胞在实验组与对照组均为17%～19%，二组比较差异无统计学意义，P>0.05；同时按抗体水平高低分三组比较，三组间差异无统计学意义，P>0.05。

2.4H1N1疫苗接种儿童CCR7和CD62L记忆T细胞亚群检测结果记忆T细胞(CD45RO+)再根据归巢受体(CD62L)和趋化因子受体(CCR7)表达与否，将CD8+记忆T细胞进一步分为即CD62L+、CCR7+细胞二个不同的细胞亚群；CD8+CD45RO+记忆T细胞二个亚群检测结果(见图4)：实验组与对照组CCR7单阳性记忆T细胞亚群分别是41.42%和43.31%；二组比较差异无统计学意义，P>0.05。CD62L在实验组与对照组分别是17.00%和60.55%，二组比较实验组明显低于对照组，P<0.05。

图5　流感H1N1疫苗接种儿童疫苗特异性细胞增殖指数检测结果Fig.5　Detection results of cellular proliferation index after immunization with H1N1 influenza vaccine for children

2.5H1N1疫苗接种儿童疫苗特异性细胞增殖指数检测结果细胞免疫功能状态的检测常常以细胞增殖实验的结果进行考核，本研究在应用CCK-8法检测疫苗刺激后抗原特异性增殖，检测结果(见图5)可见细胞增殖指数大于0.8的仅为51.16%，大于1.0在本研究中没有。

3讨论

流行性感冒简称流感，是一种急性呼吸道传染病，致病原为流行性感冒病毒，人群普遍易感。其中，甲型流感病毒对人类的威胁最大，最容易形成大流行[1]。2009年暴发严重的 “甲型H1N1流感” 疫情[2]，为有效应对甲型H1N1流感疫情，我国新甲型H1N1流感疫苗从研制到临床应用仅3个月完成，全国开展了有关人群免疫接种，对于当时社会稳定和提高人群特异性免疫力做出了重要贡献。从2009年应用至今，缺乏远期免疫持久性的研究报告。免疫记忆是疫苗学的基础，长期来对远期免疫效果及免疫记忆以产生抗体及抗体的滴度进行评价[3]，Sallusto等[4-7]研究表明体内确实存在记忆B细胞和记忆T细胞，而对细胞内感染的微生物抗感染，T细胞介导的免疫应答更为重要[8]，从而对记忆性T细胞有了新的认识[9]。在正常人周围血中，T淋巴细胞是多种表型的细胞亚群组成。根据功能与MHC分子的限制性不同，T细胞可分为CD4+和CD8+T细胞[10-14]。CD8+T细胞的TCR识别的抗原肽被MHCⅠ类分子呈递。CD8+T细胞主要介导细胞毒性T细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)的细胞毒活性表现为直接对靶细胞的杀伤或通过细胞因子介导细胞毒。本研究对流感H1N1疫苗接种31例儿童外周血细胞进行分离培养，以流式细胞仪检测CD8+T细胞，结果PBMC中CD8+T细胞在疫苗刺激实验组与对照组没有差异(P<0.05)，这一结果也与正常人外周血CD8+T细胞分布规律一致。CD8+T细胞实验组比对照组略有升高，经统计学处理无显著性差异P>0.05。这种结果提示实验组较对照组高，虽然CD8+T细胞数量少，但在疫苗刺激下均有特异性增殖。

成熟的T细胞是高度不均一的细胞群体，根据T细胞是否曾受到抗原的刺激分为初始T细胞、效应T细胞(Effector T cell,Te)和记忆T细胞[15]。目前普遍根据CD45RA的表达与否分初始T细胞(CD45RA+)和记忆T细胞(CD45RO+)两大亚群。初始T细胞是没有接受过抗原刺激的成熟T细胞，在没有接触特异性抗原分子刺激前相对静止的状态。初始T细胞能识别、结合不同的特异性抗原。在感染或用疫苗时，特异性抗原进入机体，选择性激活某些表达特异性TCR的初始T细胞克隆，并迅速增殖，分化成效应性T细胞，发挥特定的细胞免疫功能[16]。CD8+初始T细胞检测结果在实验组与对照组均高达80%以上(P>0.05)；同时按照传统考核疫苗效果以抗体水平高低分三组进行比较，三组间比较差异无统计学意义，P>0.05。提示这批31例儿童初始T细胞在比例良好，表明具有抗原再刺激后再应答的基础。CD8+记忆T细胞表达CD8+CD45RO+，再一次受到抗原刺激后，记忆T细胞能够迅速增殖，发挥效应功能，包括辅助功能、杀伤功能和调节功能[17,18]。流感病毒是细胞内感染，因此对流感疫苗诱导机体的免疫力，研究记忆细胞具有十分重要的意义。CD8+记忆T细胞检测结果在两组为17%～19%(P>0.05)；同时按照传统考核疫苗效果以抗体水平高低分三组进行比较，三组间比较差异无统计学意义，P>0.05。抗原活化反应迅速应该是CD8+记忆T细胞，本实验CD8+CD45RO+记忆T细胞在实验组占19.5%，对照组占17.5%，提示甲流H1N1疫苗接种3年多后特异性免疫记忆T细胞在数量上是不多的，其功能无特异性再次应答。

近年研究表明，记忆T细胞具有高度多样性，根据归巢受体(CD62L)和趋化因子受体(CCR7)的表达情况，可将记忆性T细胞分中央型和效应型记忆T细胞。效应型记忆T细胞(CCR7-/CD62L-)主要存在于血液、脾脏和非淋巴组织，当受到抗原的刺激后能迅速分化成效应细胞，产生效应分子。中央型记忆T细胞(CCR7+/CD62L+)存在于淋巴结、脾脏和血液不存在于非淋巴组织，当受到抗原的刺激后其分化成效应细胞及产生效应分子或对靶细胞的杀伤，其作用较慢。本研究CCR7和CD62L检测结果表明，记忆T细胞亚群表型特征大多数为中央型记忆细胞；在实验组中CCR7和CD62L单阳性记忆T细胞两者均低的同时CD62L+细胞百分比低的幅度大。这种表型特征与吴长有研究的正常人外周血记忆细胞及人外周血BCG特异性记忆T细胞研究的报道结果一致[19-21]。

在抵抗病毒感染的过程中，细胞免疫应答发挥重要作用。CD4+和CD8+T细胞是细胞免疫应答的重要组成部分。细胞增殖实验是考核免疫细胞受抗原刺激后发生应答的能力，本研究在应用CCK-8法检测疫苗刺激后抗原特异性增殖，可见细胞增殖指数大于0.8的为51.16%，大于1.0在本研究中没有，结果表明流感H1N1疫苗接种儿童疫苗特异性细胞增殖不理想。疫苗特异刺激细胞表型特征综合分析，H1N1流感疫苗远期特异性免疫记忆T细胞亚群表型特征大多数为中央型记忆细胞，这种表型特征对抗原刺激产生应答效应缓慢。目前H1N1流感疫情不容乐观，广东省2013年公布传染病数据，报告1 535例甲型H1N1流感病例，发病数是2012年的170倍左右。根据本研究结果提示，为有效预防H1N1流感建议在高危人群或流感流行季节每6个月进行一次免疫接种；从免疫记忆结果出发应该研究新型的感疫苗。由于本次研究样本量不多，流感疫苗T细胞免疫记忆也无相关研究借鉴，因此，流感疫苗免疫记忆值得我们深入研究。

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[收稿2015-06-24二次修回2016-01-08]

(编辑许四平)

Characterization of naive and memory T cell after immunization with H1N1 influenza vaccine for children

CHENJun-Ru，XIAHong-Bo,ZHUANGXue-Fen,GUOJin-Jin,TANGYan-Li,YAOXin-Sheng,SUNWan-Bang.

ShenzhenLonggangMaternalandChildHealthCareHospital,Shenzhen518000,China

[Abstract]Objective:To elucidate the characterization of CD8+T cell in H1N1 influenza vaccine for children.Methods: PBMCs were isolated from 31 children aged from 3 to 6 years old who had accepted H1N1 influenza vaccine during December 2009 to January 2010.The lymphocytes were joined with the H1N1 influenza vaccine as experimental group and cultured.The experiment set without vaccine group as control group.At last we detected the surface molecules by FCM.The CCK-8 assay was added to detecting cellular proliferation and cellular proliferation index were detected by CCK-8.Results: CD8+T cells of PBMC in the two groups were 13.41% and 9.41%,P> 0.05.CD8+CD45RAA+naive T cells in the two groups were up to more than 80%,P> 0.05.The proportion of CD8+CD45ROA+memory T cells in two groups were up to 17%-19%,P> 0.05.Two subsets of CD8+CD45ROA+memory T cells :CCR7+and CD62L+single positive memory T cell subsets in the experimental group were significantly lower than that of the control group,P<0.05.The CCK-8 assay was added to detect cellular proliferation.Only 51.16% of which cellular proliferation index was greater than 0.8,with none was greater than 1 in this study.Conclusion: This study showed that the CD4+T cells were low-level,naive T cells (CD8+CD45RAA+)were higher,with antigen stimulation and response.H1N1 vaccination specific memory T cells were few in number,specific memory T cell subsets were diversity,control memory cells were the main phenotypic characteristics.Cellular proliferation index showed that the proliferation of specific CD8+T cells vaccine was poor.

[Key words]Children；H1N1 vaccine；Immune vaccine；Memory T cell； Immunization long-term；Immune memory

中图分类号R392.1

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)03-0396-05

作者简介：陈珺汝(1980年-)，女，硕士，主要从事儿童预防保健研究，E-mail:13590221386 @163.com。通讯作者及指导教师：孙万邦(1950年-)，男，教授，硕士生导师，主要从事分子与临床免疫学研究，E-mail:sunwb7224@sina.com。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.022

①本文为深圳市龙岗区科技计划医疗卫生项目(201406093001035)和国家自然科学基金项目(81441048)。

②共同第一作者，遵义医学院珠海校区免疫学教研室，珠海519041。