史振伟　许　焱　李晓璐　刘庆阳

(煤炭总医院肾内科，北京100028)



银耳多糖改善脓毒症小鼠调节性T细胞的免疫活性①

史振伟许焱李晓璐刘庆阳②

(煤炭总医院肾内科，北京100028)

[摘要]目的：探讨银耳多糖(TPS)对脓毒症小鼠外周血调节性T细胞免疫调节的作用。方法：雄性BALB/c小鼠(20±1)g，采用烧伤后腹腔注射铜绿假单胞菌制作脓毒症并予以TPS干预，随机分成5组，分别为正常对照组(未做任何处理)，未刺激组(烧伤后铜绿假单胞菌感染未经TPS处理组)，TPS低剂量组(烧伤后铜绿假单胞菌感染+50 mg/kg治疗组)，TPS中剂量组(烧伤后铜绿假单胞菌感染+100 mg/kg治疗组)，TPS高剂量组(烧伤后铜绿假单胞菌感染+200 mg/kg治疗组)，从各组的外周血中分离调节性T细胞，并体外培养。自烧伤即刻(PBD0)起，至烧伤后4 d每天监测培养上清液中IL-10、IFN-γ、IL-4的水平。磁珠孵育和磁性分离小鼠外周血的调节性T细胞(CD4+CD25highTregs)和CD4+T细胞，分别加入TPS后进行培养，以不加TPS的细胞作为对照，流式细胞仪分析CD4+CD25highTregs的表型，ELISA法检测细胞因子的表达。结果：与对照组相比，TPS能显著降低未刺激组小鼠的IL-10和IL-4的分泌，并显著增加IFN-γ的分泌，并且IL-10的分泌水平与TPS浓度呈剂量效应关系。体外培养试验中，与正常对照组相比，未刺激组的CD4+ T细胞增殖和IFN-γ水平显著降低(P<0.05)，IL-4水平显著升高(P<0.05)；与未刺激组相比，TPS刺激组的CD4+T 细胞增殖和IFN-γ水平显著升高(P<0.05)，IL-4水平显著降低(P<0.05)；与未刺激组相比，TPS刺激+抗体1组CD4+T 细胞增殖和IFN-γ水平显著升高(P<0.05)，IL-4水平显著降低(P<0.05)；与未刺激组相比，TPS刺激+抗体2组的CD4+T 细胞增殖和IFN-γ、IL-4水平无显著性差异。结论：TPS可以通过降低IL-10的分泌抑制CD4+CD25highTregs对CD4+ T淋巴细胞增殖和极化的影响，并诱导CD4+T淋巴细胞向Th1分型，从而使机体免疫活性增强。

[关键词]银耳多糖；调节性T淋巴细胞；脓毒症；烧伤；IL-10

研究证明，调节性T细胞在脓毒症中起重要作用，其主要功能是在患者创伤后抑制T细胞的增殖，并抑制Th1型细胞因子的产生。脓毒症的免疫反应是诱导促炎反应和抗炎反应达成一个复杂的平衡状态，从而限制对宿主组织的损伤，调节性T细胞在这种平衡中起了至关重要的作用，如果调节性T细胞的负向免疫调节占了主导地位，平衡将会消失,进而出现无法治愈的免疫抑制。众所周知，在脓毒症后期会出现无法控制的免疫抑制状态，这是多器官功能障碍综合征甚至死亡的主要原因[1-3]。银耳多糖(Tremella polysaccharides,TPS)具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化老化、降低血糖、抗凝血血栓形成、抗溃疡、促进蛋白质合成、抗病毒、促进神经细胞的生长和改善记忆等生物活性，已被证实具有改善免疫抑制状态的作用[4]。本研究观察TPS对分泌IL-10的调节性T细胞亚群——CD4+CD25highTregs功能的影响，旨在为探讨TPS干预烧伤后脓毒症后期免疫抑制状态的机制提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂TPS(陕西慈缘生物技术有限公司)，抗IL-10抗体(美国eBioscience公司)，RPMI-1640、胎牛血清(FCS)、谷氨酰胺、青霉素、链霉素和HEPES(北京天润善达生物技术有限公司)，小鼠CD4+CD25highTregs微磁珠(德国MiLtenyi Biotec公司)，噻唑蓝(MTT)和TritonX-100(Sigma公司)，异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗小鼠CD4、藻红蛋白，PE标记抗小鼠CD25和纯化大鼠抗小鼠CD3和CD28(BD/PharMingen公司)，IL-2 酶联免疫检测试剂盒、IL-4 酶联免疫检测试剂盒和干扰素-γ酶联免疫检测试剂盒(Biosource公司)，ATCC27853 铜绿假单胞菌 (ATCC 公司,美国)。

1.1.2动物雄性BALB/c小鼠，6～8周龄，体重(20±1)g(中国医学科学院，北京实验动物中心)。自由进水进食，人工照明，保持 12 h 开/关。所有实验动物的护理和使用均严格遵守国家研究所健康指南。

1.2方法

1.2.1烧伤后铜绿假单胞菌感染模型建立根据随机数字表法分三组：假烫对照组；烫伤+细菌组。在小鼠的背部用水浴(37℃)持续接触 8 s，计算烫伤面积 10%总体表面积(TBSA)背部烫伤；此为假烫组。烫伤细菌组在小鼠的背部用开水(100℃)持续接触8 s，计算烫伤面积 10%TBSA Ⅲ°；在烧伤后1 d(PBD1)，小鼠背部创面中心注射 50 μl的 ATCC27853 铜绿假单胞菌菌液(1×106CFU)，此为模型组。在PBD 1、2和3，小鼠腹腔注射TPS(50、100和200 mg/kg)。

1.2.2实验设计105只小鼠被分为五组，各组分组情况如下:A.假烧伤组 BALB/c小鼠5只；B.烧伤+铜绿假单胞菌感染组 BALB/c小鼠25只；C.烧伤+铜绿假单胞菌感染+TPS(50 mg/kg)治疗组 BALB/c小鼠25只；D.烧伤+铜绿假单胞菌感染+TPS(100 mg/kg)治疗组 BALB/c小鼠25只；E.烧伤+铜绿假单胞菌感染+TPS(200 mg/kg)治疗组 BALB/c小鼠25只。B、C、D、E组再分出4个亚组，每组有5只小鼠，小鼠们分别在烧伤后1、2、3、4 d被处死，另外有5只小鼠被作为正常对照组。在指点时间点处死所有的小鼠，立即收集外周血样本用以获得Tregs和T淋巴细胞。

1.2.3磁珠孵育和磁性分选外周血Treg和CD4+T淋巴细胞富集的小鼠外周血T淋巴细胞，不含抗体及磁珠，细胞计数，用于下游实验。Treg淋巴细胞的纯化通过Treg试剂盒选出；CD4+T淋巴细胞使用CD4+T淋巴细胞试剂盒分选得到，操作步骤严格按说明书进行。

1.2.4细胞培养细胞在RPMI1640中培养并加入2 nmol/L的L-谷氨酰胺，5 mmol/L的HEPES和100 U/ml青霉素，100 mg/ml链霉素(BioWhittaker公司),0.5 mmol/L的丙酮酸钠，0.05 mmol/L的非必需氨基酸和5%血清。50 ml 抗CD3抗体稀释到PBS(Life Technologies公司)，以5或0.05 mg/ml的指定浓度加入到每个培养孔，放置在37℃下4 h，并然后用PBS洗涤两次。

1.2.5酶联免疫吸附分析细胞因子含体积分数10%胎牛血清-RPMI1640完全培养基重悬CD4+CD25highT淋巴细胞，调整细胞密度为1×106个/ml，取0.2 ml接种于96孔细胞培养板，另加TPS处理(200 μg/ml，以不加TPS的细胞作为对照)。24 h后收集上清液，采用ELISA测定IFN-γ、 IL-4水平，严格按说明书步骤操作。

1.2.6混合淋巴细胞体外反应检测脾T淋巴细胞增殖功能及Th1/Th2功能性极化磁珠孵育和磁性分选小鼠烧伤后第二天(PBD2)、第三天(PBD3)及第四天(PBD4)外周血Treg和正常鼠CD4+T淋巴细胞，将CD4+T淋巴细胞分为正常对照组(未作任何处理)，未刺激组(加入未经TPS处理的Treg淋巴细胞与CD4+T淋巴细胞混合培养)，TPS刺激组(加入经200 μg/ml TPS处理后的Terg淋巴细胞与CD4+T淋巴细胞混合培养)，TPS刺激+抗体1组(加入经200 μg/ml TPS处理后的Treg淋巴细胞、IL-10抗体与CD4+T淋巴细胞混合培养)和TPS刺激+抗体2组(加入经200 μg/ml TPS处理后的CD4+CD25highT淋巴细胞、IL-10的同型对照抗体与CD4+T淋巴细胞混合培养)。混合培养24 h后采用含体积分数10%FBS-RPMI1640完全培养基重悬脾T淋巴细胞，调整细胞密度为5×106个/ml，取0.2 ml接种于48孔细胞培养板，另加100 μl 刀豆素A(5 μg/ml)进行刺激。常规培养18 h，加入不同细胞数的Treg淋巴细胞，使培养液中Treg淋巴细胞与脾T淋巴细胞的细胞比例为1∶100，每组3个平行孔。孵育68 h，再向各孔加入10 μl噻唑蓝(5 mg/ml)，轻微振荡，继续培养4 h。加100 μl Triton-异丙醇溶液，37℃温箱过夜，测定波长540 nm下吸光度值以检测脾T淋巴细胞增殖功能；分别于刺激后3 d留取上清，应用流式细胞磁珠分析术(Cytometric beads array system，CBA)检测各组上清中IFN-γ、IL-4水平(分别反映Th1和Th2改变)，首先对含IL-4、IFN-γ等两种CBA微球进行抗体包被，并对所包被的IL-4、IFN-γ抗体进行标染，染色满意后，采用流式细胞仪进行检测。

2结果

2.1TPS抑制调节性T细胞IL-10的分泌从各组的外周血中分离调节性T细胞，并在体外培养。自烧伤即刻(PBD0)起，至烧伤后4 d每天监测培养上清液中IL-10的水平，并记录下来(表1)。未刺激组中IL-10的水平异常增高，TPS显著降低IL-10水平，并呈剂量依赖性(P<0.05)。

2.2TPS影响调节性T细胞IFN-γ、IL-4的分泌从各组的外周血中分离出调节性T细胞，并在体外培养后，自烧伤即刻(PBD0)起，至烧伤后4 d每天监测培养上清液中的IFN-γ、IL-4(图1)。图A中可以看出，与未刺激组比较，不同时间点TPS处理组IFN-γ的水平升高，而IL-4水平降低，并呈现剂量依赖关系(P<0.05)。不同剂量的TPS处理组与未刺激组相比，由CD4+T细胞产生的IL-4的水平显著增加(P<0.05)，与此相反，IFN-γ的水平显著降低(P<0.05)。

2.3在体外TPS对脓毒症小鼠的CD4+T细胞的增殖和分化以及IFN-γ、IL-4分泌水平的影响

2.3.1TPS影响脓毒症小鼠的CD4+T细胞的增殖和分化体外培养试验中，与正常对照组相比，未刺激组的CD4+T细胞增殖和IFN-γ水平显著降低(P<0.05)，IL-4水平显著升高(P<0.05)；与未刺激组相比，TPS刺激组的CD4+T 细胞增殖和IFN-γ水平显著升高(P<0.05)，IL-4水平显著降低(P<0.05)；与未刺激组相比，TPS刺激+抗体1组CD4+T 细胞增殖和IFN-γ水平显著升高(P<0.05)，IL-4水平显著降低(P<0.05)；与未刺激组相比，高浓度TPS刺激+抗体2组的CD4+T 细胞增殖和IFN-γ、IL-4水平无显著性差异。见表2。

IL-10BurnsepsisTPS(50mg/kg)TPS(100mg/kg)TPS(200mg/kg)PBD0150±12151±11149±15150±16PBD1321±14291±19275±13237±21PBD2353±18316±21281±18243±19PBD3501±28399±181)298±201)2)252±171)2)PBD4375±17228±19237±16185±22

Note：1)P<0.05，compared to burn sepsis；2)P<0.05 compared to TPS group(50 mg/kg).

图1　TPS处理后调节性T细胞产生的IFN-γ和IL-4的变化Fig.1　Effect of TPS on CD4+ T cells proliferation in septic miceNote: Compared to burn sepsis,*.P<0.05；compared to TPS group(50 mg/kg)，#.P<0.05.

TimeCD4+TCD4+T+TregCD4+T+Treg+TPS(200μg/ml)CD4+T+Treg+anti-IL-10CD4+T+Treg+IL-10IsotypePBD20.52±0.031)0.27±0.050.48±0.071)0.37±0.041)0.26±0.04PBD30.51±0.021)0.16±0.060.46±0.061)0.34±0.031)0.14±0.05PBD40.54±0.041)0.31±0.020.47±0.051)0.38±0.041)0.31±0.03

Note：1)P<0.05，compared to CD4+CD25highT cells+CD4+T cells.

TimeCD4+TCD4+T+TregCD4+T+Treg+TPS(200μg/ml)CD4+T+Treg+anti-IL-10CD4+T+Treg+IL-10IsotypePBD2209±281)108±21199±271)175±191)121±23PBD3211±311)89±17195±251)169±211)95±19PBD4198±271)105±19201±181)181±201)117±16

Note：1)P<0.05，compared to CD4+CD25highT cells +CD4+T cells.

CD4+TCD4++TregCD4++Treg+TPS(200μg/ml)CD4+T+Treg+anti-IL-10CD4+T+Treg+IL-10IsotypePBD2102±171)285±24121±191)187±161)277±22PBD3111±211)291±27132±221)193±191)283±25PBD4123±191)248±23148±281)178±301)237±32

Note：1)P<0.05，compared to CD4+CD25highT cells +CD4+T cells.

2.3.2在体外TPS对CD4+T细胞的IFN-γ、IL-4分泌影响通过表3、4看出，正常对照组、未刺激组、TPS刺激组、TPS刺激+抗体1组和TPT刺激+抗体2组IFN-γ、IL-4的水平，其中TPS刺激组和TPT刺激+抗体1组IFN-γ明显高于未刺激组(P<0.05)，IL-4明显低于未刺激组(P<0.05)，TPS刺激+抗体2组与未刺激组无显著性差异。

3讨论

在过去的20年里，尽管大量抗生素和其他支持治疗不断进展，脓毒症仍然是重症监护病房的首要死亡原因。并且这些病人均有免疫功能抑制[5]。脓毒症中的免疫抑制，亦称“免疫麻痹”，是以包括单核细胞失活，内毒素耐受，中性粒细胞功能受损，淋巴细胞功能障碍和凋亡为特点[6]。最近的研究主要集中在实验和临床脓毒症病人调节性T细胞表型和功能上[7]。

调节性T细胞比例的持续性增加与较差的长期预后是有一定关联的。因此推测调节性T细胞的异常变化可能是脓毒症的一个重要的致病因素。调节性T细胞的免疫抑制机制有待确定，这些细胞通过细胞间的直接接触或间接通过抗炎介质的分泌(如：IL-10)可以抑制免疫细胞功能[8]。IL-10是一种抗炎细胞因子可以抑制促炎细胞因子的生产。本实验结果显示：产生IL-10的调节性T细胞在烧伤脓毒症小鼠体内显著增加，CD4+T细胞的增殖被显著抑制，烧伤后绿脓杆菌感染后Th2细胞的细胞因子IL-4异常增强，IFN-γ明显下降，以上表明在脓毒症晚期Th1和Th2之间的应答平衡遭到破坏。因此，我们推测在脓毒症晚期，调节性T细胞的异常活动不利于脓毒症的恢复。

体外实验的结果证实自烧伤后脓毒症小鼠体内分离出来的调节性T细胞可显著抑制CD4+T细胞的增殖，并且抗IL-10抗体可部分阻断调节性T细胞对CD4+T细胞的抑制效果，与体内结果相一致。

有研究表明：中药作为免疫调节剂可用于提高免疫力。银耳多糖有免疫调节功能，可对抗化疗药物引起的免疫抑制[4]。目前还不清楚TPS能否通过改善调节性T细胞的异常活动而改善脓毒症。为此，我们应用银耳多糖治疗遭受烧伤及绿脓杆菌感染的小鼠，观察了TPS在调节性T细胞的调节免疫活动中的作用，TPS可以通过降低IL-10、IL-4，增加IFN-γ的分泌水平抑制CD4+CD25highTreg对CD4+T淋巴细胞的增殖作用；体外实验中，在混合淋巴细胞反应之前，CD4+CD25highTreg细胞先用TPS(200 μg/ml)刺激，我们发现，TPS显著逆转的CD4+CD25highTreg介导的CD4+T细胞的增殖和分化诱导的调节性T细胞的变化，二者结果一致。因此，TPS可以抑制调节性T细胞的功能，调节T淋巴细胞由Th2转化为Th1，最终改善脓毒症预后。

参考文献：

[1]Mills KH.Regulatory T cells:friend or foe in immunity to infection? Nat Rev Immunol,2004，4(11):841-855.

[2]Vincent JL,Opal SM,Marshall JC,etal.Sepsis definitions:time for change[J].Lancet,2013,381(9868):774-775.

[3]Hotchkiss RS,Monneret G,Payen D.Sepsis-induced immunosupp-ression:from cellular dysfunctions to immunotherapy[J].Nat Rev Immunol,2013，13(12):862-874.

[4]Shi ZW,Liu Y,Xu Y,etal.Tremella polysaccharides attenuated sepsis through inhibiting abnormal CD4+CD25(high) regulatory T cells in mice[J].Cell Immunol,2014,288(1/2):60-65.

[5]Hotchkiss RS,Karl IE.The pathophysiology and treatment of sepsis[J].N Engl J Med,2003,348(2):138-150.

[6]Cohen J,Vincent JL,Adhikari NK,etal.Sepsis:a roadmap for future research[J].Lancet Infect Dis,2015,15(5):581-614.

[7]Liu QY,Yao YM,Yu Y,etal.Astragalus polysaccharides attenuate postburn sepsis via inhibiting negative immunoregulation of CD4+CD25(high) T cells[J].PLoS One,2011,6(6):e19811.

[收稿2015-06-11修回2015-07-06]

(编辑张晓舟)

Tremella Polysaccharides attenuated sepsis through inhibiting abnormal CD4+CD25highregulatory T cells in mice

SHIZhen-Wei,XUYan,LIXiao-Lu,LIUQing-Yang.

DepartmentofNephrology,ChinaMeitanGeneralHospital,Beijing100028,China

[Abstract]Objective:To determine the effects of TPS on peripheral blood Tregs in sepsis mouse induced by burn plus P.aeruginosa infection.Methods: The experimental mice were separated into five groups randomly,including sham burn group,burn plus P.aeruginosa infection group,burn plus P.aeruginosa infection with TPS (50,100,200 mg/kg) treatment group.Peripheral blood Tregs were isolated with Magnetic Microbeads and cultured in vitro from the day after burn(PBD0) to 4 days after burn(PBD4).IL-10,IFN-γ,IL-4 levels in Tregs culture supernatants were determined by sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA).Purification of CD4+CD25highTregs and CD4+T cells in C57BL/6 mice were administrated by magnetic beads sorting.Tregs and CD4+T cells were cultured in vitro after joining TPS to without TPS cells as a control.The phenotypes of Tregs were analyzed by flow cytometry,and cytokines were measured by ELISA.Results: Vis-a-vis the results of the untreated group,TPS could markedly decrease IL-4 and IL-10 secretion level and significantly increase the secretion of IFN-γ,and the secretion of IL-10 level and concentration of TPS dose effect.Vis-a-vis the results of the untreated group,in vitro experiment,without stimulation of TPS,CD4+T cell proliferation and IFN-γ were significantly reduced(P<0.05)and IL-4 levels increased significantly;CD4+T cell proliferation and IFN-γ were significantly increased and IL-4 levels were significantly reduced in the group of TPS with antibody-1;there was no significant difference in CD4+T cell proliferation and the levels of IFN-γ and IL-4 in the group of TPS with antibody-2.Conclusion: TPS could inhibit the abnormal activities of CD4+CD25highTregs in burn with P.aeruginosa infection mice,at least in part via inhibiting IL-10 secretion,and trigger a shift of Th2 to Th1 with activation of CD4+T cells in burn with P.aeruginosa infection mice.

[Key words]Tremella polysaccharides;Tregs;Sepsis;Burn;IL-10

中图分类号R5

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)03-0313-05

通讯作者及指导教师：刘庆阳(1979年-)，男，博士，副研究员，主要从事脓毒症临床及基础研究。

作者简介：史振伟(1971年-)，男，博士，副主任医师，主要从事肾脏疾病透析治疗及基础研究。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.004

①本文为国家自然科学基金(81000847，81272140)、中国博士后面上项目(201150M1530)和中国博士后第五批特别资助项目(2012T50863)。

②同时供职于解放军总医院第一附属医院全军烧伤研究所，北京100048。