杨　红，李　赓，陈飞飞，张　洁，孔　瑞

(合肥学院 生物与环境工程系，合肥　230601)



黑啤中浑浊和泡沫蛋白性质初探

杨红，李赓，陈飞飞，张洁，孔瑞

(合肥学院 生物与环境工程系，合肥230601)

摘要：泡沫是啤酒的重要特征，泡沫蛋白是构成啤酒泡沫的骨架，泡沫蛋白的含量和性质在一定程度上决定了啤酒泡沫的质量。啤酒是一种成分复杂的胶体溶液，其稳定性较弱，啤酒在贮藏中极易产生浑浊沉淀，浑浊蛋白是构成啤酒浑浊的重要成分之一。以黑啤为原料，根据SDS-PAGE原理，按浓缩胶5%，分离胶12%，浓缩电压75V，分离电压120V，分离时间3h，分析啤酒泡沫蛋白和浑浊蛋白的分子量范围。结果表明：啤酒泡沫蛋白的分子量为42.4kDa 和14.1 kDa，啤酒浑浊蛋白的分子量分别为47.72kDa、42.08kDa、36.57kDa、32.44kDa、28.02kDa，两者蛋白的分子量之间有一定交集。为进一步分析啤酒中浑浊活性蛋白与泡沫蛋白的相关性提供基础数据。

关键词：黑啤；浑浊蛋白；泡沫蛋白；分子量

啤酒是人类最古老的酒精饮料之一，富含丰富的CO2，有细腻且洁白的泡沫，具有麦芽及酒花的香味和酒花爽口的苦味，是继可可和茶之后世界上消耗量排名第三的饮料。啤酒因含有丰富的氨基酸、多种维生素、较多的无机离子等营养成分，故而被称为“液体面包”。在我国，啤酒的发展速度惊人，仅2003年，中国的啤酒生产产量已达世界第一。[1-2]啤酒泡沫能阻止啤酒与空气中氧的接触，减缓啤酒的氧化进程。丰富良好的泡沫还能防止啤酒中风味物质的溢出，带给消费者不一样的感官享受。泡沫的质量很大程度上影响啤酒的质量，其稳定性、洁白程度、泡持性、细腻程度、挂杯性等是评价啤酒泡沫质量的重要指标。泡沫蛋白质、异α-酸、CO2、金属离子等组成了啤酒泡沫。

啤酒泡沫蛋白是能够维持泡沫稳定性的一类蛋白质，又被称为起泡蛋白或泡沫性蛋白。[3]根据相对分子质量可将泡沫蛋白分为两大类：一类是分子量为35-50kDa的高分子蛋白质，主要包括蛋白质Z；[4]一类是分子量约为7-9kDa的低分子蛋白质，主要包括脂转移蛋白(LTP),主要来源于麦芽。[5]啤酒泡沫中少量存在一些可能来源于酵母的蛋白质(约200KDa)。研究表明，啤酒泡沫蛋白之间并不是相互独立的，而是相互作用的，这些相互作用影响着啤酒的起泡和泡沫的稳定性。[5]

啤酒也是一种成分复杂的胶体溶液，其稳定性较弱，故啤酒在贮藏中极易产生浑浊沉淀。根据浑浊的可逆性将啤酒浑浊分为冷浑浊和永久性浑浊。目前为止，蛋白质-多酚的复合是引发啤酒浑浊的最常见原因，一般认为永久性浑浊的前驱物质是冷浑浊，永久性浑浊的结构更为复杂。[6]Siebert认为，蛋白质和多酚是引发啤酒产生冷浑浊的重要因素，在啤酒中，若浑浊敏感多酚和敏感蛋白的含量较高且基本等量，会导致二者发生聚合反应，产生蛋白质-多酚浑浊。[7]Siebert基于实验进一步提出，一个多酚分子最多可接受两个蛋白分子，啤酒中的敏感蛋白或者敏感多酚过量，都是不能形成浑浊的。Chapon提出的蛋白质-多酚平衡论与Siebert的观点相一致，蛋白质-多酚平衡论如下图所示。

P+T←→P-T(可溶性) ←→(不可溶性)

P：蛋白质T：多酚

Chapon认为，一般情况下，单体P和T在啤酒中是平衡的，若将这种平衡打破，除去单体中的P或T，会使得上述平衡向单体方向移动，啤酒的稳定性提高。在实际的生产中，可运用上述的平衡论提高啤酒的稳定性，具体的做法是去除或者过量添加蛋白质和多酚中的一个。[8-9]

浑浊对啤酒最大的影响是可以缩短其货架寿命。[10]为提高啤酒的稳定性，避免浑浊的产生，一般有两种思路：一是按照一定的比例，同时除去蛋白质和多酚；二是除去蛋白质或者多酚。为提高啤酒的稳定性，又尽可能不降低啤酒中营养成分，特别是蛋白的含量。因此如何去除浑浊活性蛋白而又不影响泡沫蛋白就显得尤为重要。本研究以合肥学院自酿黑啤为原料，分析其浑浊活性蛋白和泡沫蛋白的分子量，为研究两者之间的相关性及提高啤酒稳定性和风味获得基础数据资料。

1材料与方法

1.1实验材料

丙烯酰胺、双丙烯酰胺、Tris碱、SDS(十二烷基磺酸钠)、TEMED、过硫酸铵、β-巯基乙醇、甘油、溴酚蓝甘氨酸、考马斯亮蓝G-250、 Marker 购买自北京索莱宝科技有限公司。

1.2仪器与设备

RP5002K电子天平，湖南湘仪仪器公司；RO 300-E超纯水仪，上海和泰仪器有限公司；DKS-28恒温水浴锅，上海博讯有限公司；PHS-2F 型pH，上海雷磁公司；D-1008微型离心机，北京大龙公司；CJ88-1磁力搅拌器，江苏金坛仪器有限公司；DYCZ-25D微型垂直电泳槽，北京六一公司。

1.3样品准备

1.3.1泡沫蛋白的制取

采用分液漏斗收集啤酒泡沫。[11]将500mL黑啤沿漏斗边缘倒入2L分液漏斗中，速度要保持匀速，加盖5s后，打开出样阀，放出酒液直到有泡沫流出为止，立即关闭阀门，控制酒液在60s内放完，泡沫自然坍塌后收集泡沫生成的液体。[12]

样品处理方法是，取泡沫生成液200uL，以1：5的比例加入4℃丙酮溶液，将混合液置于冰箱中，放置1h，7000rpm离心10min，倒掉上层的液体，用纯水洗3-4次后，加40uL纯水复溶。

1.3.2浑浊蛋白的制取

将啤酒在冰箱中放置24h，然后倒掉上层的酒液，下层的溶液用滤纸过滤，取适量的沉淀物加50uL水复溶，以1∶5的比例加入4℃丙酮，置于冰箱中1h后，7 000rpm离心10min，倒掉上层的液体，用纯水洗3—4次后，加30uL水复溶。

1.4SDS-PAGE电泳实验

1.4.1溶液的配置

依据参考文献[13]，分别配制1.5M Tris-Hcl(pH8.8)、1M Tris-Hcl(pH6.8)、10%(w/v)SDS、50%(v/v)甘油、1%(w/v)溴酚蓝、丙烯酰胺储存液、浓缩胶缓冲液、10%过硫酸铵、电泳缓冲液、样品缓冲液、固定液、脱色液、12%分离胶和5%浓缩胶溶液备用。

1.4.2实验操作

1.4.2.1制胶

(1)按照使用说明书组装凝胶模具。

(2)灌制12%的分离胶：将配置好的分离胶溶液轻轻搅拌使其均匀(过量的气泡会干扰聚合)，用一次性吸管将凝胶溶液沿隔片缓慢加入模具中(注入的速度应时刻保持匀速，避免混入气泡)，凝胶加至玻璃板顶端1.5cm时，为使凝胶变得平整，应在分离胶溶液上覆盖一层水。当凝胶聚合后(时间应控制为40～60min)，分离胶与水的分界面将会清晰的显现。

(3)用吸水纸将分离胶上层的水吸出，并用浓缩胶缓冲溶液清洗2-3次。

(4)灌制5%的浓缩胶：摇匀浓缩胶溶液，用一次性吸管将浓缩胶溶液匀速注入到模具中，溶液加至玻璃的顶端后，将梳子插入凝胶内，待浓缩胶聚合后拔出梳子。

1.4.2.2电泳

(1)将得到的泡沫蛋白样品、浑浊蛋白样品以及Marker以1∶1的比例与样品缓冲液混合，在100℃的水浴锅中沸腾4～10min；

(2)将制好的胶在12V的电压下，预跑20min；

(3)沸腾后的样品和Marker冷却后加入少量的β-巯基乙醇；

(4)根据蛋白质的浓度和上样孔的体积，用微量注射器将合适量的溶液加入到浓缩胶孔道里，未上样的孔道中加入等量的样品缓冲液，以防止跑道的扩散；

(5)蛋白质浓缩时，电压为75～80V，当蛋白质开始分离时，将电压调为120V。当溴酚蓝跑到凝胶底部立即关闭电源，停止电泳；

(6)将玻璃板放置于有水的盆中，用刀划开玻璃板，取出凝胶并作标记；

(7)凝胶放入固定液中固定30min，随后进行染色和脱色，染色的时间不宜太长，控制在15min左右；脱色完成后，将凝胶置于扫描仪中扫描，得出图片进行结果分析。

2结果与讨论

2.1泡沫蛋白结果分析

2.1.1泡沫蛋白电泳图

按照1.3.1的方法制备啤酒泡沫蛋白样品，将处理好的样品加入1.5mm的凝胶样品槽进行电泳操作，得到的凝胶用扫描仪扫描，并进行灰度转化，结果如下图1所示。

2.1.2标准曲线的制作

将迁移距离最大的标准蛋白或者凝胶片的前沿作为参考点，计算所有标准蛋白的相对迁移率(mR)。

以mR为横坐标，标准蛋白质分子量为纵坐标，依据图1中标样计算，绘制出泡沫蛋白的标准曲线见图2所示。所得方程为y=114.87e-2.1397x，R2=0.98。

图1　泡沫蛋白凝胶电泳图(1、2—泡沫蛋白样品)

图2　泡沫蛋白电泳实验中marker相对分子质量与相对迁移率关系图

2.1.3泡沫蛋白分子量的计算

根据图1中样品计算出泡沫蛋白的mR分别是0.465 8和0.981 9，将mR带入公式中，可计算出泡沫蛋白的分子量分别是42.4KDa和14.1KDa。

2.1.4结果讨论

实验测出啤酒泡沫蛋白的相对分子量分别为42.4KDa和14.1KDa。根据资料可知，相对分子量为42.4KDa的蛋白质，应该是蛋白质Z，蛋白质Z是发现最早的与啤酒泡沫性能有关的蛋白质，蛋白质Z有两种异构体，分别为Z4和Z7。报道指出，糖基化的蛋白质Z在煮沸过程中有可能抑制蛋白质沉淀析出，并且能增强泡沫稳定性。[14]脂转移蛋白(LTP)是由91个氨基酸组成的来源于大麦胚乳的蛋白质，LTP有两种异构体，分别是分子量约为9KDa的LTP1，和分子量约为7KDa的LTP2，LTP1具有很强的起泡性，能够富集在啤酒的泡沫中，LTP2对泡沫质量的影响还需进一步研究。[5]实验中测出的分子量为14.1KDa的蛋白质，与LTP的分子量相近，有两种可能性，一是12%分离胶未能将LTP1和LTP2很好的分离，导致两种蛋白质重合在一起；二是12%分离胶未能将LTP分离出，分子量为14.1KDa的是另一种能够对啤酒泡沫起作用的蛋白质。

2.2浑浊蛋白结果分析

2.2.1浑浊蛋白电泳图

按照1.3.2的方法制备啤酒浑浊蛋白样品，将处理好的样品加入1.0mm的凝胶样品槽进行电泳操作，得到的凝胶用扫描仪扫描，并进行灰度转化，结果如下图3所示。

2.2.2标准曲线的制作

将迁移距离最大的标准蛋白或者凝胶片的前沿作为参考点，计算所有标准蛋白的相对迁移率(mR)。

以mR为横坐标，标准蛋白质分子量为纵坐标，依据图3中标样计算，绘制出浑浊蛋白的标准曲线见图4所示。所得方程为y=114.75e-2.3966x，R2=0.979 9。

图3浑浊蛋白凝胶电泳图(1、2、3—浑浊蛋白样品)

图4浑浊蛋白电泳实验中marker相对分子质量与相对迁移率关系图

2.2.3浑浊蛋白分子量的计算

根据图3中样品计算出浑浊蛋白的mR分别是0.366 1、0.418 6、0.477 2、0.527 1和0.588 3，将mR带入图中的公式中，可计算出浑浊蛋白的分子量分别是：47.72KDa、42.08KDa、36.57KDa、32.44KDa、28.02KDa。

2.2.4结果讨论

蛋白质与多酚是啤酒产生浑浊的主要原因，在啤酒中蛋白质与多酚能发生聚合反应，生成蛋白质-多酚复合物，产生浑浊。复合物中蛋白质被称为浑浊活性蛋白质，多酚被称为浑浊活性多酚，当蛋白质分子中含有脯氨酸时才是浑浊活性蛋白(简称HA蛋白)。[15]对于啤酒中浑浊活性蛋白来说，HA蛋白的中必需含有脯氨酸，脯氨酸的含量与蛋白形成浑浊的程度呈正相关，啤酒浑浊蛋白相对分子质量分布在10-60KDa这个范围内，其含量约占啤酒含氮物质的1/3。实验测出啤酒中浑浊蛋白的分子量分别为47.72KDa、42.08KDa、36.57KDa、32.44KDa、28.02KDa，均分布在10~60KDa这个范围内。

3结论

黑啤中泡沫蛋白的分子量分别为42.4KDa和14.1KDa，浑浊蛋白的分子量为47.72KDa、42.08KDa、36.57KDa、32.44KDa、28.02KDa。黑啤中泡沫蛋白和浑浊蛋白在分子量上是有重叠区域的，因而在生产上去除浑浊活性蛋白时要充分考虑到重叠区域可能存在的泡沫蛋白。为黑啤生产中从浑浊活性蛋白角度降低浑浊度以及提高啤酒泡沫性能、啤酒风味提供基础数据。

参考文献：

[1]顾国贤.酿造酒工艺学[M].北京：中国轻工业出版社，1996：40-56.

[2]管敦仪.啤酒工业手册：修订版[M].北京：中国轻工业出版社，1998：31-33.

[3]叶俊华,顾国贤,陆健.啤酒泡沫中发泡蛋白的研究进展[J].酿酒，2003，30(6)：51-54.

[4]Evans D E,Robinson L H,Sheehan M C,et al. Application of Immunological Methods to Differentiate between Foam-positive and Haze-active Proteins Originating from Malt[J]. Journal of the American Society of Brewing Chemists,2003,61(2): 55-62.

[5]Jegou S,Douliez J P,Molle D,et al. Purification and Structural Characterization of LTP1 Polypeptides from Beer[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2000,48(10):5023-5029.

[6]王成红.国外啤酒混浊及其预测方法[J].酿酒科技，2000(6)：86-88.

[7]王鹃，郝俊光，顾国贤.啤酒多酚—蛋白质沉淀及低温酒精冷混浊预测啤酒保质期[J].酿酒，2003，30(4)：51-53

[8]Chapon L. Nephelometry as a Method for Studying the Relations between Polyphenols and Proteins [J]. Journal of the Institute of Brewing，1993，99(1)：49-56.

[9]Siebert Karl J.,Nataliia V. Troukhanova. Nature of Polyphenol-protein Interactions [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，1996，44(1):80-85.

[10] 史经略.硅凝胶的制备及对提高啤酒非生物稳定性作用的研究[J].淮阴工业专科学校学报，1999，8(4): 34-36.

[11] 叶俊华.啤酒泡沫蛋白的性质研究和制备[D].无锡：江南大学生物工程学院，2004.

[12] 张吉磊.啤酒泡沫蛋白的研究—蛋白质Z和LTP的初步研究[D].无锡：江南大学生物工程学院，2010

[13] 郭尧君.蛋白质电泳技术[M].北京：科学出版社，1999:123-154.

[14] Andrea C,Giovanna P,Luca F,et al. Major Proteins of Beer and Their Precursors in Barley: Electrophoretic and Immunological Studies [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，1995,43(10): 2620-2626.

[15] 陈立奇.啤酒冷混浊的分析与研究[D].天津：天津科技大学生物工程学院，2006.

[责任编辑:李军]

Preliminary Study on the Properties of Haze-active and Foam Protein in Dark Beer

YANG Hong,LI Geng,CHEN Fei-fei,ZHANG Jie，KONG Rui

(Department of Biological and Environmental Engineering,Hefei University,Hefei 230601,China)

Abstract:Foam is an important feature of beer.Foam protein is the skeleton of beer foam.The quality of beer was been determined by the content and properties of foam protein in a certain extent. Beer is a kind of colloid solution with complex composition,the stability is weak. The beer is very easy to produce haze and precipitate during the storage.Haze-active protein is one of the important components of beer haze.In this paper,in accordance with the principle of SDS-PAGE,at 5% of the concentrated gel,separating gel of 12%,concentrated voltage of 75V,separation voltage of 120V,separated for 3h,to analysis the molecular weight range of foam protein and haze-active protein in dark beer. Results show that the molecular weight of beer foam protein were 42.4 kDa and 14.1 kDa,one of the haze-active protein in dark beer were 47.72 kDa,42.08 kDa,36.57 kDa,32.44 kDa and 28.02 kDa. The molecular weight of the two proteins has a certain intersection.It could provided basic data for further analysis of the correlation between the foam protein and the haze-active protein in beer.

Key words:dark beer; haze-active protein; foam protein; the molecular weight

中图分类号：TS2

文献标识码：A

文章编号：1673-162X(2016)01-0100-05

作者简介：杨红(1981—)，男，安徽舒城人，合肥学院生物与环境工程系副教授，硕士；研究方向：食品生化与生物统计。

基金项目：安徽省高校省级优秀青年人才基金重点项目(2013SQRL079ZD)、安徽省大学生创新创业训练计划项目(AH201411059043)、国家级大学生创新创业训练计划项目(201511059079)基金资助。

收稿日期：2015-12-01修回日期：2016-01-06