潘浩王荻卢彤岩

（1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，哈尔滨 150070；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306）

渔用药物防耐药策略研究进展

潘浩1，2王荻1卢彤岩1

（1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，哈尔滨 150070；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306）

目前，药物治疗仍然是防治水产动物病害的主要方法，但其不合理应用也诱发了大量耐药细菌的产生。如何制定合理的渔用常用药物防耐药用药策略已成为目前研究的重点。系统的综述了耐药突变选择窗理论、中草药防耐药应用及养殖条件影响在防耐药用药策略方向的研究进展。

联合用药；中草药；养殖环境；防耐药策略

近些年由于抗生素的过度及不合理利用，加速了细菌耐药性的产生［1-8］。究其原因，抗生素单从一方面对细菌进行抑制，一旦细菌适应并产生耐药，此类抗生素的效果就大打折扣。因此如何制定抑制、杀灭病菌的同时避免耐药性产生的科学合理的用药策略是目前渔用药物研究者研究的热点问题。

1 耐药突变选择窗理论及其防耐药用药策略

1.1 防耐药变异浓度和耐药突变选择窗

防耐药变异浓度（mutant prevention concentration，MPC）这一概念是由美国学者Drlica［9］于2000年提出的，指的是一个防止耐药的抗菌药物浓度阀值，即防止细菌产生耐药性的抑制细菌生长的药物浓度。是评价抗菌药物抑制细菌生长效应的指标，反映的是药物抑制细菌发生耐药突变的能力。Dong等［10］研究发现，在琼脂平板上接种的细菌数量超过1010CFU的时候没有发现细菌变异，这个能使细菌不产生耐药性的药物浓度值就是MPC。当抑菌药物浓度达到MPC以上的时候细菌必须同时发生两处耐药突变才能生长。而细菌同时发生两次耐药突变的概率仅为10-14，这是一个极低的概率，因而抗菌药物浓度在MPC之上时细菌大部分被杀死，基本不可能产生耐药突变菌株［10，11］。最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC），是测定抗菌药物抑制细菌活性大小的指标，其定义为体外培养18-24 h后能抑制培养基内细菌生长的最低药物浓度，当药物浓度低于MIC时，药物抑菌效果消失但不会导致细菌耐药突变体产生。而当药物浓度介于MPC与MIC之间时，即便有很高的几率抑制甚至杀灭细菌，但也很容易出现耐药突变体，介于这两者之间的浓度范围就是耐药突变选择窗（mutant selection window，MSW）［12］。

1.2 基于MSW理论的防耐药用药策略

MSW理论认为当药物浓度在MPC之下，并且在MIC之上的时候，才会导致细菌耐药突变体的选择性富集并且产生抗性。因此，可以通过选择使用低MPC、窄MSW的药物调整用药方案或是通过药物的联合使用缩小或关闭MSW［13］。缩小或关闭MSW将会有极少甚至不会有耐药突变体产生，可以将选择性突变菌株扩增的机率降到最低。因此，可以通过使药物浓度快速达到峰值，并且在最短的时间内通过MSW，将血浆药物在MSW的滞留时间降到最低，使其处于MPC以上的时间升到最高，以达到最大限度地缩短突变选择时间的目的。方法二是缩小MIC与MPC的差距，缩小或者关闭MSW。其三是采取联合用药的方法，因为当两种或多种不同作用机制的药物同时存在于细菌生存的环境中时，细菌要继续生长必须同时发生两种及以上的耐药突变，而发生两种及以上的突变的概率极低，这样就可以达到最大限度关闭MSW以抑制细菌同时防止耐药菌株的产生。

联合用药是除了保证药物达到合适的药物浓度（MPC）之外的另一种经常采用的防耐药用药策略。单一药物治疗的关键是组织或血液药物浓度要高于药物用药安全剂量的MPC，并且在MSW以上的时间越长越好。然而在联合使用几种作用机制不同的药物时，由于临床安全剂量难以达到各自的MPC，因此可以通过匹配24 h用药时曲线下面积（AUC24）与最小抑菌浓度（MIC）的比值（AUC24/MIC）来关闭MSW，这样可以在达到理想的治疗效果的同时尽量避免耐药突变体的出现。

联合用药所引起的药物相互作用的改变是使药物效应改变［14］，这种改变可能是作用性质的变化，也可能是效应强度改变，从而对药物的有效性和安全性产生影响。药物联合使用所引起的药效包括：使原有的效应增强，即协同作用；使原有的效果减弱，即拮抗作用；产生毒性等不良反应，即毒副作用；以及可能出现的互不影响的结果。因此在用药的时候要充分了解药物的药效，避免拮抗作用与毒副作用的发生。

2 中草药防耐药用药策略

中草药由于其有效成分复杂、作用机制多样，实验发现体外抑菌试验很难解释中草药在体内的抗菌作用，这表明中草药除了其表现出来的抑菌作用外，可能还存在其他作用机制协助进行抑菌，推测是通过其对细菌以及细菌所寄生的机体进行的多环节多途径的综合作用来实现［15］。近年来，中草药在抑菌机制及防耐药用药策略方面的应用也有了较系统的研究进展。

2.1 中草药抑菌成分与机制

近几年来，中草药抑菌成分的研究方向逐渐转向生物碱、黄酮类、多酚类及萜类等方面。随着医学技术的进步及新的仪器的研发，对含酚类成分的中草药，如低分子质量的有蒽醌及异戊烯黄酮，高分子质量的有多酚类及原花色素、水解单宁等中草药的研究也越来越多。

目前许多研究者认为，中草药的抗菌作用机制主要包括抑制菌体内能量的生成、抑制细菌生物膜的形成、改变细胞膜和离子通道的通透性、抑制细菌体内酶的活性、增强中性粒细胞的吞噬功能、代谢产物发挥抗菌作用、抑制细菌蛋白质的合成及减少细菌内毒素的释放。

2.2 中草药逆转细菌耐药性研究

在研究新型抗生素药物的同时，越来越多的学者开始把目光转向使抗性细菌恢复对抗生素药物的敏感性方面。由于成分复杂中草药在这方面有其特有的优势，并且一些相关研究也证实中草药在此方面具有较好的功效。

2.2.1 消除抗药性（R）质粒 在1970年之后，国内外许多研究人员在试验中通过消除细菌的R质粒使细菌恢复对抗菌药物的敏感性，但由于西药的毒副作用较强，一直未能取得较好的效果，因此开始把目光投向传统中草药。研究结果表明，中草药对消除细菌R质粒的效果良好［16］，而且中草药由于其作用机制对R质粒的消除作用体内明显强于体外，这可能是因为在体内细菌不仅受到药物的抑制作用与机体的免疫作用，特别是先天性免疫系统的影响，而且同时还与受到机体的内环境的影响有关。

目前，对中草药黄芩、黄连进行的相关研究较多，两者联用效果明显，可使R质粒消除率提高10倍以上，其效果远高于西药。不同组分的中草药对R质粒消除率也不同，如从艾叶得到的乙醇提取物对R质粒的消除率可达69.4%，艾叶提取的挥发油对R质粒的消除率可达16.67%［17］。中草药千里光对大肠杆菌R质粒消除作用显著，且含药血清消除作用达14.9%［18］，明显强于其水浸液。从R质粒消除的表型来看，经千里光水浸液作用后细菌均表现为单一耐药性的丢失，而含千里光血清对其消除作用表现为多重耐药性的丢失，其中以四环素的耐药性消除最多。鞠洪涛等［19］研究表明，大蒜油等对大肠埃希氏菌氨苄青霉素的耐药性有明显消除作用。

2.2.2 抑制细菌主动外排泵 主动外排机制是多数耐药菌耐药性产生的原因之一，也是细菌多重耐药性产生的原因之一［20］。诸多研究表明，中草药可以通过抑制多种外排泵的活性使耐药菌恢复对药物的敏感性。宋战昀等［21］构建了含有norA外排泵基因介导的金黄色葡萄球菌的多重耐药菌株，并筛选了4种中草药浙贝母、射干、穿心莲和菱角的提取物发现，这些中草药的提取物可以抑制外排泵介导的金黄色葡萄球菌的耐药性，并可以在不同程度上对金黄色葡萄球菌的耐药性产生逆转作用。adeABC基因的过度表达导致鲍曼不动杆菌对环丙沙星产生耐药性［22］，从中草药萝芙木根中提取的生物碱利血平对外排泵基因adeABC的表达有抑制作用，从而使鲍曼不动杆菌部分恢复对环丙沙星的敏感性。

2.2.3 抑制超广谱β-内酰胺酶（ESBLs） β-ESBLs产生抑菌作用是因为它可以水解抗菌药物的有效成分，降低抗菌药物的抑菌效果从而使细菌产生耐药性。目前研究表明，部分中草药可以抑制产ESBLs细菌菌株水解抗菌药物，使其恢复对抗菌药物的敏感性。刘平等［23］研究发现黄芩、黄柏、黄连、连翘和千里光这5种中草药的提取物可以抑制产ESBLs细菌的抗药性，与其他4种药物相比黄芩抑菌效果更好。三黄汤、黄连解毒汤和五味消毒饮可以逆转产酶大肠杆菌的抗药性，其机制也是通过抑制ESBLs 的活性和表达以产生逆转效果的［24］。

2.2.4 抑制耐药基因的表达 余道军等［25］研究表明，提取蟾酥皮肤腺及耳后腺分泌的白色浆液，其水提液和醇提液在与含有耐药基因TEM和CTX-M-9的大肠杆菌作用5 d后，可使细菌耐药基因的mRNA的表达丧失，失去翻译蛋白质的功能，恢复了对药物的敏感性。

2.3 中草药用药策略

目前关于中草药对细菌的抑制作用机制和逆转细菌耐药性使其恢复对药物敏感性的研究还处于初级阶段，而且目前研究的大部分抑菌实验是针对孤立单一的已产生耐药性的菌株，还没有大量进行以菌群为单位的抑菌实验研究。中草药抗菌的理念与中医有相通之处，并非要将细菌全部杀灭，而是调整菌群与机体之间的“失衡状态”以实现菌群与所寄生的机体之间的“再平衡”为目的。这与现代医学提倡的抑制感染菌的同时又不伤害其他细菌维持菌群在机体内的平衡的理念相吻合。目前“突变选择窗”理论提倡的关闭突变选择窗策略与多种不同机制的药物同时作用殊途同归，这也与中草药的多途径、多靶点机制具有相似性。但是中草药抗菌的多途径、多靶点机制是一个很宽泛的概念，其各成分作用途径和靶点之间是否具有协同作用、抗菌作用机制与逆转细菌耐药性之间是否存在相关性等问题还有待深入研究。

3 养殖环境对防耐药策略的影响

有研究表明，温度、盐度、光照等环境条件和药物种类、给药方式、动物种类等因素可能会影响药物动力学参数及残留消除规律，如何合理调整养殖条件进而满足MSW防耐药用药策略要求的快速达峰，缩短血浆药物浓度在MSW的滞留时间以避免耐药性的产生，也逐渐受到渔药给药策略制定研究人员的关注。3.1 水流对防耐药策略的影响

水流对鱼类生存、生长影响巨大。水流通过刺激鱼类的感觉器官，使其产生相应的行为反应和活动方式，进而影响鱼类的运动方式、摄食、生长、代谢等生命活动［26-30］。宋波澜等［31］以多鳞四须鲃幼鱼为研究对象，研究逆流条件下多鳞四须鲃幼鱼体内代谢活动与药物残留，与静水对照组相比的结果表明，停药后各时间点（1、2和4 d）2.0 BL/s流速组鱼肌肉盐酸诺氟沙星含量均显著减少（P<0.05），在停药第6天药物浓度已低于检出限，而静水对照组则在停药12 d才低于检出限，说明逆流运动在一定程度促进鱼体内的代谢，加速体内残留药物的排除。药物在体内快速代谢减少了药物在MSW的滞留时间，可有效降低细菌耐药性的产生。刘海生等［32］对宽鳍鱲幼鱼的研究也表明，水流刺激可以加速鱼的代谢活动。

3.2 温度对防耐药策略的影响

温度对鱼的生长具有很大的影响，通过控制水温来达到增强鱼体代谢的目的，从而加速药物在体内的代谢，减少滞留时间以降低细菌耐药性的产生。Lermen等［33］研究证实不同温度（15、23和31℃）对银鲶血液、肝脏和肌肉的代谢参数具有显著的影响作用。杨贵强等［34］对溪红点鲑幼鱼的研究表明，在（5.5±0.5）℃-（17.5±0.5）℃温度范围内，随温度的上升耗氧率和排氨率均显著升高。汪文选等［35］对恩诺沙星在鲫鱼体内的药动学研究表明20℃药时曲线下面积、消除半衰期明显大于25℃，而清除率明显小于25℃。在鲫鱼的肾脏和肝脏中，20℃药物的达峰时间、分布半衰期、消除半衰期、药时曲线下面积均明显大于25℃，而清除率明显小于25℃。对花尾胡椒鲷［36］、瓦氏黄颡鱼［37］、石斑鱼［38］、石鲷［39］、鮸［40］、鲤［41］和鲶［42］等研究也表明，温度通过影响鱼体组织的代谢率会对鱼体排泄率产生一定影响，并且氨氮排泄率也会随温度升高而增加。可见，水温条件在一定程度上影响着药物在水产动物体内的代谢和消除，故而在实际养殖给药时应适当考虑不同水温条件以确定合理的用药策略，以达到降低细菌耐药性产生的目的，在确保食品安全的同时可以通过减少在体内的滞留时间以达到降低细菌耐药性的目的。

3.3 盐度对防耐药策略的影响

盐度是鱼类生理与生化反应的重要影响因子，主要通过对渗透压的调节来影响鱼类体内的能量代谢［43］。在高、低渗透压两种情况下鱼体会有不同的适应机制：高渗透压下通过增加内环境的渗透压；低渗透压下启用主动运输或离子转运蛋白的途径来转运离子［44］。而这两种机制都需要额外能量的消耗，这也在一定程度上加速鱼的机体代谢，从而会加速药物在体内的代谢，减少滞留时间以降低细菌耐药性产生的可能。李金兰等［45］对卵形鲳鲹的研究表明，在盐度 15-30 时，随盐度增大卵形鲳鲹的耗氨率、排氨率、代谢率及排泄率均呈U型抛物线变化，并在盐度20-25时有最小值。对中华圆田螺［46］、三疣梭子蟹［47］、中华绒螯蟹［48］及罗非鱼［42］的研究均表明盐度对机体的代谢有着显著的影响。因此，可以考虑在用药后调节水体的盐度以加快药物在鱼体的代谢过程，减少细菌耐药性产生的可能。

3.4 光照对防耐药策略的影响

在水产养殖中，光照是一个重要而且复杂多变的生态因子。对生活在水体的生物而言，光照是一个具体而易变的因子［49］。王馨等［50］对三疣梭子蟹研究表明，在5种光照强度（0、200、800、1 500和3 500 lx）下，三疣梭子蟹的耗氧率和排氨率均有显著差异，并且在1 500 lx 光照强度下，琥珀酸脱氢酶的活力处在较高水平，乳酸脱氢酶处在较低水平，表明蟹的有氧代谢能力高，整体代谢水平较高。另外有研究表明，光照可以通过影响牙鲆激素分泌而加速代谢［51，52］。制定最适的防耐药用药策略是否应考虑光照因素的影响尚待进一步深入研究。

4 展望

细菌对抗菌药物的耐药性问题是21世纪对人类威胁最大的健康问题之一。药物在使用的时候不仅要控制细菌感染，还应防止细菌耐药性的产生，更重要的是要将药物对目标细菌外的菌群的影响降到最低。在选择抗菌药物及用药方案的时候，不仅要考虑药物的生物利用度、生物有效性、组织分布与药效参数，还应全方面综合考虑细菌发生耐药突变的机制、MPC和MSW。对于耐药严重的细菌不能一味加大用药剂量或频频更换药物，要转换用药思路，采用相互拮抗的药物组合杀死耐药菌、协同型药物组合杀死敏感菌以控制感染，当然用药的前提是要筛选出合适的药物组合。目前中草药消除细菌耐药性的研究基本上还处于起步阶段，但中草药抑制剂作为纯天然制剂，同时作为一种新理论、新方法在临床中对解决日趋严重的耐药菌感染具有不可替代的作用和地位，同时也为遏制人源和动物源性细菌耐药性的交互传播、抑制细菌耐药性提供了新的思路与方法。

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（责任编辑 狄艳红）

Research Progress on the Strategies of Preventing Drug-resistance in Fishery

PAN Hao1，2WANG Di1LU Tong-yan1
（1. Heilongjiang River Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Harbin 150070；2. College of Fisheries and Life Sciences，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306）

Currently，the drug treatment is still the main way of preventing and controlling the aquatic animal diseases，but abuse of drugs has also led to a large number of drug-resistant bacteria. How to formulate a reasonable strategies of preventing drug-resistance while applying common drugs in fishery has become the focus on the current study. This paper systematically reviewed the window theory of drugresistant mutation selection，and the research progress on the strategies of preventing drug-resistance such as applying Chinese herbs and the effects of culture conditions.

drug combination；Chinese herbs；culture environment；strategies of preventing drug-resistance

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.005

2015-06-30

公益性行业（农业）科研专项经费（201203085）

潘浩，男，硕士，研究方向：渔药药理及残留检测技术；E-mail：zcph6666@126.com

卢彤岩，女，博士，研究员，研究方向：水产动物病害；E-mail：lutongyan@hotmail.com