朱倩，崔毓桂

(南京医科大学第一附属医院生殖医学中心，南京　210029)



精子发生的调节机制及其进展

朱倩，崔毓桂*

(南京医科大学第一附属医院生殖医学中心，南京210029)

【摘要】精子发生是一个复杂的过程，受多种因素的精细调节以确保把正确的基因和表观遗传信息传给子代，包括激素(如FSH、LH、T和E2等)、局部调节因子(如FGF9、SHP-2以及VEGF等)以及miRNAs的调节。本文将从精子发生的激素调节、睾丸内的调节因子、miRNAs与精子发生关系等方面的研究进展进行综述。

【关键词】精子发生；生精细胞；支持细胞；激素；细胞因子；miRNAs

(JReprodMed2016，25(4)：378-383)

哺乳动物的精子发生是一个复杂的过程，可分为3个阶段：(1)精原细胞的自我更新和分化；(2)精母细胞减数分裂形成圆形精子细胞；(3)圆形精子细胞变态形成成熟的精子，即精子形成。新生小鼠睾丸生精上皮只有生殖母细胞和支持细胞。精子发生开始于出生后3 d，一部分生殖母细胞分化为分化型精原细胞，继而分化为精母细胞、精子细胞并产生可生育的精子，即第一波精子发生；另一部分生殖母细胞分化为未分化型精原细胞，继而分化为分化型精原细胞、精母细胞、精子细胞和精子，形成稳定的精子发生。精子发生是一个高效的过程，一个健康的男性每秒可以产生上千个精子。然而精子发生也是一个容易出错的过程，人类精液中只有低比例的形态正常的精子。精子发生受多种因素的精细调节以确保把正确的基因和表观遗传信息传给子代，包括激素、局部调节因子以及miRNAs的调节。本文综述精子发生的激素调节和睾丸内的局部调节，及其相关研究进展。

一、精子发生的激素调节

精子发生受多种激素的调节，主要有卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、睾酮(T)和雌激素(E2)等。此外，其它激素也参与精子发生的调节，如胰岛素[1-2]和甲状腺激素[3]等。

1. FSH、LH、T调节精子发生

FSH和T是调节精子发生的主要激素，生精小管的支持细胞表达FSH受体和T受体，FSH在启动精子发生中发挥关键作用，FSH和T则维持精子发生；LH通过T间接参与精子发生的调节，间质中Leydig细胞表达LH受体。支持细胞与生殖细胞接触最为密切，它们为生殖细胞提供营养和支持的作用，支持细胞的数目是决定成年期生精能力的主要因素。小鼠的支持细胞数目大约在出生后15 d就固定不变；T和FSH促进支持细胞的发育。在胎儿期，雄激素还通过作用于管周肌样细胞(分泌管周肌样细胞调节支持细胞因子，PModS)调节支持细胞的发育，而出生后主要是FSH调节支持细胞的发育。在性腺机能减退小鼠，出生后雄激素产生极少，但是胚胎期雄激素的产生是正常，因此出生时支持细胞的数目是正常的。T和FSH可以单独调节精子发生也可以协同调节精子发生，支持细胞在激素调节中处于核心地位，而T对管周肌样细胞的作用对正常精子的发生也是必须的[4]。因此，管周细胞在精子发生过程的内分泌调节中也起到主要的作用。FSH对维持正常数量的精子发生是必不可少的。有研究报道促性腺激素缺乏的继发性性腺功能减退症的男性患者，在成功诱导精子发生后，仅使用绒毛膜促性腺激素(HCG)维持治疗，虽然保持有精子发生，但产生的精子数量显著减少[5]。卵泡刺激素受体(FSHR)和FSHβ敲除的小鼠能完成低水平的精子发生。这些结果提示FSH对维持正常数量的精子发生是必不可少的。精子发生的早期阶段主要受FSH调节，而晚期阶段主要受T调节。在对啮齿类动物和猴的研究中发现，精原细胞的发育以及减数分裂的起始主要受FSH的调节，而减数分裂的完成、精子形成主要受睾丸内T的调节；精子释放过程需要FSH和睾丸内T共同调节而T的作用更为重要。FSH维持粗线期精母细胞的数量，HCG能够促进粗线期精母细胞向圆形精子细胞的转化，调节减数分裂的完成[6]。黄体生成素受体(LHR)敲除的小鼠精子发生停滞在圆形精子细胞阶段；LHβ敲除的小鼠精子发生停滞在圆形精子细胞阶段，长形精子细胞和晚期的精子细胞缺乏，提示FSH和睾丸内少量的睾酮不能使精子发生越过圆形精子细胞阶段[7]。但是只有FSH而没有睾丸内少量的睾酮作用时，FSH能增加精原细胞和精母细胞的数量，促进减数分裂的开始，但不能促进减数分裂的完成，不能形成精子细胞[8]。雄激素受体(AR)完全敲除的小鼠精子发生阻滞在粗线期精母细胞；特异性敲除支持细胞上的AR精子发生阻滞在精母细胞阶段或早期精子细胞阶段。

2. E2调节精子发生

睾丸网液中有高浓度的E2，大鼠附睾中E2水平是血浆中的25倍，提示E2在精子发生和精子成熟中发挥某些作用。在未成熟期，雌激素主要由支持细胞产生；在成年期间质细胞是合成雌激素的主要场所。低浓度的E2对正常的精子发生是必须的。T对促性腺激素的反馈调节主要是通过芳香化后所产生的E2发挥作用。雌激素几乎参与精子发生的所有过程。E2能够促进原始生殖细胞[9]、生殖母细胞[10]和精原细胞的增殖[11-12]、精母细胞成熟、精子细胞分化、精子成熟和释放。在未成熟啮齿动物的睾丸，支持细胞里的芳香化酶(Ar)活性高，在成年期则间质细胞中的芳香化酶活性最高。生精细胞中也有芳香化酶存在，芳香化酶表达于粗线期、晚期精母细胞、精子细胞和精子。ER广泛分布于男性生殖道，ER有2个亚型即ERα和ERβ，但它们在睾丸细胞中的准确定位还存在争议。人类睾丸生精细胞、支持细胞、间质细胞中都有ERα和ERβ表达，也有文献报道ERβ是男性睾丸中的唯一雌激素受体。芳香化酶或雌激素受体(ER)缺乏时，雄性生殖功将明显受影响。在ArKO的雄性小鼠1年后都发生不育，精子发生阻滞在精子细胞阶段，圆形精子细胞和长形精子细胞减少了50%。在hpg小鼠E2通过ERα提高血浆FSH的水平，诱导精子发生，雄激素受体在这一过程中也发挥着重要的作用[13]。ERα还与生精小管液的重吸收有关，ERα敲除的雄性小鼠，输出小管中的液体重吸收障碍，使得精子被稀释，生精小管中的压力升高，生精上皮萎缩，精子发生障碍，小鼠不育。ERβ敲除的雄性小鼠也是不育的[14]。

研究发现G蛋白偶联受体30(GPR30)是E2调节精子发生的另一个重要的雌激素受体。Chimento等[15]通过原代培养的粗线期精母细胞发现ERα、ERβ和GPR30表达于粗线期精母细胞，且GPR30主要存在于细胞的胞浆中。E2通过ERα和GPR30，激活EGFR/ERK/c-Jun信号通路，调节细胞增殖和凋亡的基因的表达。这3种受体在精母细胞(GC-2)中也都有表达，且GPR30主要存在于胞浆和胞膜中。E2通过ERα和GPR30，激活ERK1/2、JNK和p38，进而激活线粒体凋亡通路[16]。Chimento等[17]研究还发现在原代培养的大鼠圆形精子细胞中，也都有这3种受体的表达，GPR30也主要表达于胞浆中。E2通过ERα、ERβ和GPR30，激活EGFR/ERK调节细胞分化和凋亡的基因的表达，如cyclin B1和Bax。

二、睾丸内的调节因子

精子发生的睾丸内细胞因子的调节非常复杂，此处仅例举成纤维细胞生长因子9 (FGF9)、蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)、血管内皮生长因子(VEGF)的作用。

1. FGF9：FGF9最早发现于人类神经胶质瘤细胞，它是多种细胞的有丝分裂和存活因子，具有多种生物功能包括神经发育、性别分化、骨形成、晶状体纤维分化和缝隙连接形成。FGF9是成纤维细胞生长因子家族的成员之一。成纤维细胞生长因子受体(FGFRs)是酪氨酸激酶型受体，有8种类型，即FGFR1Ⅲb，FGFR1ⅢC，FGFR2Ⅲb，FGFR2Ⅲc，FGFR3Ⅲb，FGFR3Ⅲc，FGFR4和FGFR5。其中FGF9与FGFR2Ⅲc，FGFR3Ⅲb，FGFR3Ⅲc 以及FGFR4结合。

有研究发现11.5 d.p.c的.FGF9表达于XX和XY未分化的性腺中，但在12.5 d.p.c.它局限于XY性腺中，然后表达于睾丸轴。FGF9在胚胎期的睾丸发育中发挥着重要的作用，是雄性性别决定必需的信号分子，它参与性腺细胞增殖、Sertoli细胞分化以及中肾细胞迁移，FGF9敲除的小鼠支持细胞分化停止并发生雄性向雌性的性反转。DiNapoli等[18]发现FGF9敲除的胎儿睾丸，12.5 d.p.c.时大部分生殖细胞丢失，而存活的生殖母细胞发生了减数分裂，提示FGF9是生殖细胞的存活因子并且抑制胎儿睾丸生殖细胞的减数分裂。FGF9抑制胎儿生殖细胞的减数分裂，并促进生殖细胞向雄性方向发育[19]。此外，FGF9在出生后睾丸的发育中也发挥着重要的作用。FGF9也能抑制出生后睾丸生精细胞的减数分裂。Nanos2是RNA结合蛋白，它能沉默精原细胞分化和进入减数分裂的基因，而FGF9增加减数分裂前精原细胞中的Nanos2水平抑制减数分裂[20]。Tassinari等[21]研究表明FGF9激活ERK，激活Cripto-Nodal-Smad2/3通路，促进Nanos2表达而抑制Stra8和Scp3的表达，抑制出生后精原细胞的减数分裂。Lin等[22]研究发现FGF9与睾酮生成密切相关，FGF9 和FGFR 亚型(FGFR2Ⅲc，FGFR3 和FGFR4) 的mRNA 均表达于小鼠睾丸间质细胞，并通过Ras-MAPK，PI3K 和PKA 信号通路调节睾酮的合成。

2. SHP-2：SHP-2是一种在生物体内普遍存在的具有去磷酸化作用的蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)，由PTPN11 基因编码。SHP-2作为细胞因子、生长因子及其他胞外刺激因素的下游信号分子，在细胞的生长分化以及肿瘤细胞的增殖、黏附、转移过程中起着至关重要的作用。

在人类，SHP-2突变会引起豹皮综合征(LS)和努南综合征(NS)，这2种综合症都有男性不育。Purip等研究发现SHP-2在精子发生中发挥着重要的作用。SHP-2在支持细胞发育过程中稳定地表达。在成年大鼠的睾丸中SHP-2表达于支持细胞核、生精细胞间直到生精小管管腔以及围绕长形精子细胞的支持细胞胞浆、靠近基底膜的血睾屏障区域以及精原细胞。血睾屏障在精子发生中发挥着必不可少的作用，它是相邻的支持细胞间的大的连接复合体，包括紧密连接、粘着连接、缝隙连接。SHP-2是血睾屏障和精子细胞-支持细胞粘附的一个重要的调节因子。SHP-2作为肝细胞生长因子(HGF)的下游因子调节血睾屏障的功能。SHP-2能够通过Src激酶上调ERK1/2的活性，而ERK1/2的激活能够破坏血睾屏障。局部粘着激酶(FAK)是维持血睾屏障完整性的重要调节因子，它可以与SHP-2相互结合，SHP-2能够减少FAK的酪氨酸磷酸化。超表达SHP-2能够使紧密连接和粘着连接的完整性缺失、肌动蛋白细胞骨架裂解以及紧密连接和粘着连接蛋白N-cadherin、β-catenin，和ZO-1错误定位[23]。SHP-2参与胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)信号通路调节精原干细胞的增殖与存活。缺乏SHP-2使得精原干细胞增殖和存活发生障碍，不能产生未分化的精原细胞，精子发生被阻滞在起始阶段，但是未分化精原细胞以后的生精细胞能够完成精子发生，因此SHP-2在精原干细胞的发育中发挥着必不可少的作用[24]。

3. VEGF：VEGF家族是一类多功能的细胞因子，由于能够有效的刺激内皮细胞有丝分裂和诱导血管生成而得名。该家族有7个成员：VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，VEGF-E，VEGF-F及胎盘生长因子(PIGF)，三种受体：VEGFR-1，VEGFR-2及VEGFR-3. 在促进内皮细胞增值、存活和分化中VEGF-A 发挥最为重要的作用。VEGF-A基因由8个外显子和7个内含子构成，通过基因转录的mRNA的不同剪切方式产生许多亚型，包括VEGFA121、VEGFA145、VEGFA165和VEGFA206等。VEGF-A主要与FLT1 (即 VEGFR1)和KDR (即VEGFR2或FLK1)结合发挥其生物学作用。

VEGF，特别是VEGF-A，对男性生殖具有重要作用。它通过自分泌和旁分泌的方式，调节男性生殖系统各器官血管生成、睾丸支持细胞和间质细胞功能以及睾丸激素生成，对精子的发生、发育及成熟产生重要的影响。研究发现VEGF-A表达于支持细胞、间质细胞、生殖母细胞、精原细胞、精母细胞以及精子中。VEGF-A也表达于前列腺、精囊和精液中；在人、大鼠、小鼠和牛的睾丸生殖细胞中都有VEGFR2表达。支持细胞和生殖细胞分泌的VEGF-A对未分化精原细胞的维持、精子的数目和正常的男性生殖是必不可少的。敲除支持细胞和生殖细胞中的VEGF-A，小鼠的体重、附睾以及前列腺的重量减轻，改变了细胞凋亡和调节未分化精原细胞功能的基因，未分化精原细胞的数量减少，精子数目的减少，降低了小鼠的生育力[25]。VEGF-A调节鹿的精原细胞的增殖和精子形成[26]。Caires 等[27]运用SSC 移植技术证明了VEGFA在精原干细胞的稳态中发挥着重要作用，VEGF-A164促进精原干细胞的自我更新，而 VEGFA165b促进精原干细胞的分化，VEGF-A 亚型的平衡对于精原干细胞池和男性生殖是非常重要的。用单细胞悬液从头形成睾丸组织时，添加VEGF-A 165不能增加血管和生精小管的形成，但是它能增加每个生精小管中精原细胞的含量，对生殖细胞的形成具有保护作用[28]。

三、miRNAs与精子发生

miRNAs是一类小的非编码单链RNAs，由20～25核苷酸组成。它通过使mRNAs降解或抑制蛋白翻译参与基因表达的转录后调节。大量的研究证明miRNAs与精子发生密切相关。大量的miRNAs表达于生精细胞中，在精子发生中发挥着重要的作用。miRNAs调节精原细胞的自我更新和分化。miR20 和miR106a在转录后水平调节STAT和Ccnd1，调节精原干细胞的自我更新[29]。miR135a通过Foxo1调节精原干细胞的功能[30]。miR-544抑制PLZF的表达，调节雄性生殖干细胞(mGSC)的自我更新和分化[31]。miR-146在小鼠未分化的精原细胞中高表达，它参与维甲酸诱导的精原细胞的分化[32]。Yang等[33]研究发现抑制未分化精原细胞的miR-221/222可以诱导精原细胞的分化，而超表达miR-221/222抑制精原细胞的分化，miR-221/222通过抑制KIT的表达维持哺乳动物精原细胞的未分化状态。研究发现miRNAs在减数分裂以及减数分裂后的生殖细胞中也是必不可少的。例如，miR-34c表达于精母细胞和圆形精子细胞.抑制初级精母细胞中的miR-34c能够增加Bcl-2/Bax的比值，抑制睾酮缺乏诱导的生殖细胞凋亡。超表达miR-34c诱导GC-2细胞凋亡，抑制miR-34c可降低GC-2细胞凋亡，miR-34c促进雄性生殖细胞凋亡是通过ATF1(转录激活因子1)发挥作用的[34]。Bao 等[35]研究表明 miR-449也表达于精母细胞和精子细胞，在睾丸发育和成年后的减数分裂开始时表达量增加。CREM和SOX5调节减数分裂及减数分裂后的miR-449的活性，在miR-449敲除的小鼠发育和精子发生都是正常的，但miR-34b/c的表达是增加，miR-34b/c可以补偿miR-449的功能，二者通过E2F-pRb途径调节男性生殖细胞的发育。但是miR-449和miR-34b/c都敲除的小鼠精子发生严重受损，出现少弱畸精子症，引起不育[36-37]。再例如，过渡蛋白2(TNP2)和鱼精蛋白2(PRM2)是调节精子形成过程中染色质凝集和压缩的重要因子；miR469能够抑制TNP2和PRM2蛋白的翻译，影响正常精子的产生[38]。miRNAs参与精子发生调节及其机制，是当前男科学领域的研究热点之一。

四、结论与展望

精子发生涉及激素、局部调节因子等多种因素的调节，近年发现miRNAs参与调节作用。越来越多的精子发生调节因子被发现，大大丰富了我们对精子发生及相关机制的认识，对治疗男性不育症和男性避孕具有重大的意义。

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[编辑：郭永]

Research progress of regulatory mechanism of spermatogenesis

ZHUQian，CUIYu-gui*

ClinicalCenterofReproductiveMedicine,FirstAffiliatedHospital,NanjingMedicalUniversity,Nanjing210029

【Abstract】Spermatogenesis is a complex process, and it is strictly regulated for correct transmission of genetic and epigenetic information to subsequent generation. FSH, LH, T and E2 are the main hormones that regulate spermatogenesis. Apart from the hormones, some local regulators, such as FGF9, SHP-2 and VEGF etc., as well as miRNAs also play important roles in regulation of spermatogenesis. The research progress of hormone regulation, cytokine in testis, and miRNA related with spermatogenesis was reviewed in this paper.

【Keywords】Spermatogenesis;Germ cells;Sertoli cells;Hormones;Cytokines;miRNAs

【作者简介】朱倩，女，江苏镇江人，硕士研究生，生殖医学专业.(*通讯作者，Email：cuiygnj@njmu.edu.cn)

【基金项目】国家自然科学基金(81370754，81170559)；江苏省卫生厅科教兴卫工程(ZX201110)

【收稿日期】2015-06-30；【修回日期】2015-08-25

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.04.018