红细胞生成素对肠缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究*

刘启胜程正位熊建光程思李湘楚#

湖北省咸宁市中心医院消化内科(437000)

背景：炎症反应是肠缺血再灌注损伤(IRI)的重要发病机制之一，而红细胞生成素(EPO)具有抗炎活性。目的：探讨EPO对肠IRI的保护作用及其可能机制。方法：32只健康雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组(sham组)、IRI组、EPO组和740Y-P组。IRI组、EPO组和740Y-P组以夹闭(45 min)-开放肠系膜上动脉建立肠IRI模型，术前1 h分别腹腔注射0.9% NaCl溶液、EPO和EPO+740Y-P。再灌注1 h后处死大鼠，观察小肠组织病理学改变，以蛋白质印迹法检测PI3K/Akt、NF-κB信号通路相关蛋白表达，以real-time PCR和ELISA法检测炎症因子白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达和分泌。结果：与sham组相比，IRI组小肠组织损伤评分、PI3K、p-Akt、p-NF-κB p65蛋白表达、IL-8、TNF-α、MCP-1 mRNA表达和血清水平显著升高(P<0.05)。EPO预处理能明显改善IRI模型大鼠的小肠组织病理学改变，抑制PI3K/Akt、NF-κB信号通路激活，下调炎症因子表达、分泌，PI3K激动剂740Y-P则能减弱EPO的上述作用。结论：EPO预处理可通过抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路激活而抑制炎症反应，从而对肠IRI发挥保护作用。

关键词肠；再灌注损伤；炎症；红细胞生成素；PI3K/Akt；NF-κB

Protective Effect and Potential Mechanism of Erythropoietin on Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

LIUQisheng,CHENGZhengwei,XIONGJianguang,CHENGSi,LIXiangchu.

DepartmentofGastroenterology,XianningCentralHospital,Xianning,HubeiProvince(437000)

Correspondence to: LI Xiangchu, Email: 23843212@qq.com

Background: Inflammation plays an important role in intestinal ischemia-reperfusion injury (IRI), and erythropoietin (EPO) has been reported to have anti-inflammatory activity. Aims: To explore the protective effect of EPO on intestinal IRI and its potential mechanism. Methods: Thirty-two healthy male Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups: sham operation group (sham group), IRI group, EPO group and 740Y-P group. Rats in IRI, EPO and 740Y-P groups were injected intraperitoneally with 0.9% NaCl, EPO and EPO+740Y-P, respectively, one hour before the establishment of intestinal IRI model by superior mesenteric artery clamping (45 min)-reperfusion. All rats were sacrificed one hour after reperfusion. Histopathological changes of small intestine were observed; expression of proteins in PI3K/Akt and NF-κB signaling pathways was measured by Western blotting; expression and secretion of inflammatory cytokines, including interleukin-8 (IL-8), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) were examined by real-time PCR and ELISA. Results: Compared with sham group, the damage score of small intestine, protein expressions of PI3K, p-Akt and p-NF-κB p65, as well as mRNA expressions and serum levels of IL-8, TNF-α and MCP-1 in IRI group were significantly increased (P<0.05). EPO pretreatment could ameliorate the histopathological changes of small intestine in IRI model rats, inhibit PI3K/Akt and NF-κB signaling activation and down-regulate expression and secretion of inflammatory cytokines. When 740Y-P, a PI3K agonist, was used combinedly, the effect exerted by EPO was diminished. Conclusions: EPO pretreatment can protect against intestinal IRI by inhibiting the activation of PI3K/Akt/NF-κB signaling and the subsequent inflammatory response.

Key wordsIntestines;Reperfusion Injury;Inflammation;Erythropoietin;PI3K/Akt;NF-kappa B

肠缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury, IRI)好发于心肺体外大循环手术、严重创伤、肠移植等临床危重症患者[1]，可导致肠道功能严重受损，肠屏障功能急剧降低，肠内大量细菌和毒素易位进入体循环，激活单核-巨噬细胞系统，引起大量促炎细胞因子释放，诱发全身性炎症反应综合征(SIRS)甚至多器官功能衰竭[1-2]。因此，减少促炎细胞因子释放、抑制炎症反应是减轻肠IRI的有效途径。红细胞生成素(erythropoietin, EPO)是一种由肾脏产生的具有多种生物学效应的糖蛋白[3]，既往研究发现其可通过抑制氧化应激和细胞凋亡等途径对肠IRI发挥保护作用[4]，但EPO是否能通过其抗炎活性减轻肠IRI，目前尚不十分清楚。本研究建立大鼠肠IRI模型并予EPO预处理或EPO预处理联合PI3K激动剂740Y-P干预，通过组织病理学检查以及PI3K/Akt、NF-κB信号通路相关蛋白表达的检测，进一步探讨EPO对肠IRI的保护作用及其可能机制。

材料与方法

一、实验动物分组和处理

健康雄性Sprague-Dawley大鼠32只，体质量200~250 g，SPF级，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，质量合格证号：610037867，饲养于咸宁医学院实验动物中心。大鼠适应性喂养1周后，随机分为假手术组(sham operation组，简称sham组)、IRI组、EPO组和740Y-P组，每组8只。EPO组术前1 h腹腔注射EPO(纯度99%，Sigma-Aldrich Co.) 5 000 U/kg[4]；740Y-P组术前1 h腹腔注射EPO 5 000 U/kg+740Y-P(纯度99%，Sigma-Aldrich Co.) 3.5 mg/kg[5]；Sham组和IRI组术前腹腔注射等体积0.9% NaCl溶液。IRI组、EPO组和740Y-P组接受肠IRI造模处理：戊巴比妥钠麻醉，开腹腔，游离组织，分离暴露肠系膜上动脉，以血管夹夹闭，纱布覆盖切口，置于32 ℃温箱45 min，松开血管夹，恢复肠道血流灌注，缝合腹部，术毕回动物房，正常饮食、饮水。Sham组仅开腹，不夹闭肠系膜上动脉。造模过程顺利，各组均无动物死亡。再灌注1 h后眼内眦静脉取血，处死大鼠，收集肠道标本，用于后续实验。

二、方法

1. 小肠组织病理学检查：小肠组织标本4%甲醛溶液固定，石蜡包埋、切片，HE染色，光学显微镜下观察组织病理学改变。组织学损伤程度的评估采用Chiu肠黏膜损伤评分标准[6]：0分，正常绒毛和腺体；1分，部分绒毛顶端上皮轻度受损；2分，上皮下腺体轻度受损；3分，上皮下间隙扩大，毛细血管充血；4分，上皮与固有层中度分离，腺体受损；5分，部分绒毛顶端脱落；6分，绒毛顶端脱落明显，毛细血管扩张；7分，绒毛固有层部分脱落，腺体受损明显；8分，固有层开始消化分解；9分，出血和溃疡。

2. 蛋白质印迹法：免抗大鼠PI3K、Akt、p-Akt、NF-κB p65、p-NF-κB p65抗体购自Cell Signaling Technology, Inc.。取小肠组织称重，每50 mg组织加入1 mL RIPA裂解液，冰上匀浆，裂解30 min，4 ℃ 12 000×g离心30 min，取上清，BCA法测定蛋白浓度。50 μg蛋白质上样，SDS-PAGE电泳(5%浓缩胶，10%分离胶，恒压80~100 V)，转膜(PVDF膜，恒流300 mA)，洗膜，5%脱脂奶粉(TBST配制)封闭1 h，分别加入PI3K(1∶500)、Akt(1∶1 000)、p-Akt(1∶500)、NF-κB p65(1∶1 000)、p-NF-κB p65(1∶500)和β-actin(1∶3 000)抗体孵育过夜，振洗后加入二抗羊抗兔IgG-HRP 37 ℃孵育1 h，洗膜后加入ECL试剂，曝光、显影、定影、拍照。以Quantity One软件分析目的蛋白相对表达量，以目的蛋白条带与内参β-actin条带积分光密度值的比值表示。

3. Real-time PCR：称取适量小肠组织，于液氮中研磨成粉末状，由上海拜力生物科技有限公司完成总RNA提取，紫外分光光度法测定总RNA样品浓度和纯度。逆转录试剂盒和real-time PCR试剂盒购自Roche Diagnostics，按相应试剂盒说明书进行操作，行逆转录和real-time PCR，白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)引物信息见表1。以β-actin为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA相对表达量。

4. ELISA：大鼠IL-8、TNF-α、MCP-1 ELISA试剂盒购自上海拜力生物科技有限公司，按相应试剂盒说明书进行操作，检测血清IL-8、TNF-α、MCP-1水平(单位：pg/mL)。

三、统计学分析

表1　Real-time PCR引物信息

结果

一、小肠组织病理学改变

IRI组小肠绒毛大量脱落，肠黏膜大量炎性细胞浸润，大量毛细血管出血，坏死，溃疡形成，肠黏膜损伤评分较sham组显著升高(7.0±1.5对0.5±0.5,P<0.05)；与IRI组相比，EPO组小肠绒毛脱落、炎性细胞浸润、毛细血管出血、坏死、溃疡形成均明显减轻，肠黏膜损伤评分显著降低(2.0±0.5对7.0±1.5,P<0.05)；740Y-P组小肠损伤程度与IRI组类似，肠黏膜损伤评分显著高于EPO组 (6.0±1.0对2.0±0.5,P<0.05)(图1)。上述发现提示EPO预处理可减轻肠IRI的组织病理学改变，而740Y-P可减弱EPO对肠IRI的保护作用。

二、EPO和740Y-P对PI3K/Akt、NF-κB信号通路的影响

蛋白质印迹法检测结果显示，IRI组小肠组织PI3K、 p-Akt、 p-NF-κB p65蛋白表达较sham组显著升高(P<0.05)，EPO组上述蛋白表达均较IRI组显著降低(P<0.05)，740Y-P组p-Akt、p-NF-κB p65蛋白表达较EPO组显著升高(P<0.05)，四组间Akt、NF-κB p65蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)(图2~4)。上述发现提示IRI时PI3K/Akt、NF-κB信号通路激活，EPO预处理可抑制其激活，而740Y-P可减弱EPO的此种抑制作用。

三、EPO和740Y-P对炎症因子表达和分泌的影响

Real-time PCR检测结果显示，IRI组小肠组织IL-8、TNF-α、MCP-1 mRNA相对表达量较sham组显著升高(P<0.05)，EPO组上述mRNA表达均较IRI组显著降低(P<0.05)，740Y-P组则较EPO组显著升高(P<0.05)，相对表达量与IRI组相近。对四组血清IL-8、TNF-α、MCP-1水平的检测结果与其小肠组织mRNA表达变化相一致(表2)。上述发现提示IRI时促炎细胞因子和趋化因子的表达、分泌显著上调，EPO预处理可下调这些炎症因子的表达、分泌，而740Y-P可减弱EPO的此种抑制作用。

图1　各组小肠组织病理学改变(HE染色，×400)

**与sham组比较，P<0.01；#与IRI组比较，P<0.05

***与sham组比较，P<0.001；#与IRI组比较，P<0.05

###与IRI组比较，P<0.001；*与EPO组比较，P<0.05

组别例数小肠组织mRNA表达IL-8TNF-αMCP-1血清水平(pg/mL)IL-8TNF-αMCP-1sham组80.85±0.111.00±0.121.02±0.05100.0±10.0110.2±10.0100.0±20.0IRI组88.52±0.75a13.25±1.52a5.55±0.42a850.3±50.2a1500.2±300.2a650.2±40.1aEPO组82.52±0.52b5.15±0.52b1.52±0.52b550.2±30.9b450.0±150.0b250.0±30.0b740Y-P组87.51±0.54c13.00±1.51c4.53±0.51c750.0±40.0c1100.0±250.0c450.0±40.0c

a与sham组比较,P<0.05；b与IRI组比较，P<0.05；c与EPO组比较，P<0.05

讨论

肠IRI是肠道供血中断后重新恢复血流灌注所致的临床危象，可于严重创伤、移植、心脏旁路手术、休克等情况下发生[1]，发病率高、预后差，如何减轻肠IRI是亟待解决的重要临床问题。肠道缺血可导致机体细胞缺氧、ATP合成减少、炎症反应激活，血流灌注恢复后，炎症反应进一步加重，导致大量肠上皮细胞凋亡、坏死，使肠道损伤加剧[1-2]。EPO是调控血红蛋白合成的糖蛋白类激素，具有抗炎、抗凋亡、抗肿瘤等广泛的生物学活性[3]。鉴于炎症反应是IRI的重要发病机制之一，本研究通过建立大鼠肠IRI模型，对EPO对肠IRI的保护作用进行了探讨。研究结果显示，EPO预处理可明显减轻IRI引起的小肠损伤和炎症反应，如小肠绒毛脱落、炎性细胞浸润、毛细血管出血、坏死、溃疡等，肠黏膜损伤评分较未予EPO预处理的IRI模型大鼠显著降低。

NF-κB是调节炎症反应的重要核转录因子，其活性取决于p65亚基的激活[7]。本研究结果显示，IRI和EPO预处理对NF-κB p65表达均无明显影响，但IRI可上调其激活形式p-NF-κB p65表达，EPO预处理则可抑制IRI引起的NF-κB激活，进而抑制其下游炎症因子基因转录、表达。本研究同时检测了各组大鼠的小肠组织IL-8、TNF-α、MCP-1 mRNA表达以及三者的血清水平，证实IRI模型大鼠上述促炎细胞因子和趋化因子的表达、分泌显著上调，而EPO预处理可下调这些炎症因子的表达、分泌。EPO抑制NF-κB p65亚基磷酸化的机制尚不清楚，有待进一步研究。

PI3K/Akt为一经典信号通路，其激活可导致NF-κB 抑制蛋白(IκB)激酶(IKK)激活和IκB降解，进而激活NF-κB，调节其下游炎症反应[8]。研究[9]发现一些药物可通过抑制PI3K/Akt信号通路激活而抑制炎症反应，进而对IRI发挥保护作用。本研究进一步对EPO是否通过抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路激活而减轻肠IRI进行了探讨。各组大鼠小肠组织PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达检测结果显示，IRI可激活PI3K/Akt信号通路，表现为PI3K和p-Akt表达上调，而予EPO预处理的IRI模型大鼠两者表达均显著下调，在EPO预处理的同时予PI3K激动剂740Y-P干预则可减弱EPO的作用，740Y-P组PI3K/Akt、NF-κB信号通路激活，小肠组织IL-8、TNF-α、MCP-1 mRNA表达、三者血清水平以及小肠损伤程度均与IRI组类似，提示EPO系通过抑制PI3K/Akt信号通路，进而抑制NF-κB激活及其下游促炎细胞因子、趋化因子的表达、分泌而削弱炎症反应，从而减轻肠IRI。除通过抑制PI3K/Akt信号通路激活而抑制炎症反应外，EPO是否尚可通过其他途径参与减轻IRI，相关机制有待进一步研究。

综上所述，本实验结果提示EPO预处理可通过抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路激活而抑制炎症反应，从而对肠IRI发挥保护作用，这一发现为临床上缺血性肠病的治疗提供了新的途径。后续拟进一步探索EPO用于缺血性肠病临床治疗的剂量和给药方式。

参考文献

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8 Wang L, Xu Y, Yu Q, et al. H-RN, a novel antiangiogenic peptide derived from hepatocyte growth factor inhibits inflammationinvitroandinvivothrough PI3K/AKT/IKK/NF-κB signal pathway[J]. Biochem Pharmacol, 2014, 89 (2): 255-265.

9 Zhang J, Yao Y, Xiao F, et al. Administration of dexamethasone protects mice against ischemia/reperfusion induced renal injury by suppressing PI3K/AKT signaling[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2013, 6 (11): 2366-2375.

(2015-05-23收稿；2015-07-21修回)

*基金项目：湖北省卫生计生委科研项目(WJ2015MB299)；咸宁市科技局一般项目(201510)

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2016.01.004

#本文通信作者, Email: 23843212@qq.com