冯凯瑜，范明娟，谭荣荣，沈波，史薇，曾峥

(广州市第一人民医院老年病科，广东广州510180)

粪便中MGMT，p16INK4A及ECAD基因启动子甲基化检测在结直肠癌诊断中的价值

冯凯瑜，范明娟，谭荣荣，沈波，史薇，曾峥

(广州市第一人民医院老年病科，广东广州510180)

目的探讨粪便中p16INK4A、ECAD及MGMT基因启动子甲基化在结直肠癌诊断中的应用价值。方法选择我院老年病科2014年2月至2015年11月收治的65岁以上老年健康者50例(对照组)、结直肠镜检查证实良性结直肠疾病者41例(良性肠病组)和结直肠癌患者46例(肠癌组)为研究对象。采用表观遗传学方法应用甲基化特异PCR对上述患者粪便中p16INK4A、MGMT和ECAD基因启动子DNA甲基化进行检测，判断上述标本中各基因启动子的甲基化水平。根据p16INK4A、MGMT和ECAD基因启动子DNA甲基化水平，评价其作为诊断结直肠癌的敏感性和特异性。结果对照组、良性肠病组和肠癌组p16INK4A基因启动子DNA甲基化率分别为14.0%、24.4%和71.7%；MGM基因甲基化率分别为16.0%、14.6%和54.3%；ECAD基因甲基化率分别为12.0%、19.5%和65.2%。上述基因启动子甲基化率在肠癌组明显高于对照组和良性肠病组，差异均有统计学意义(P＜0.05)；p16INK4A、MGMT和ECAD诊断肠癌的敏感性分别为0.72、0.54和0.65，特异性分别为0.76、0.75和0.80。结论p16INK4A、MGMT和ECAD基因启动子甲基化发生率在肠癌患者粪便中显著增高，可作为肠癌诊断的分子标志物。

粪便；p16INK4A；MGMT；ECAD基因；甲基化；肠癌；诊断；敏感性；特异性

结直肠癌是全球范围内发病率较高的实体恶性肿瘤，近年来我国居民生活饮食习惯及生活方式日趋西方化，致结直肠癌发病率出现上升趋势。来自我国的临床流行病数据显示，结直肠癌死亡率居第4位，仅次于肺癌、胃癌和乳腺癌[1]，因此，探寻结直肠癌有效的诊断方法，做到早发现、早预防早治疗，是临床工作的重点。近年来肿瘤的表观遗传学研究进展对结直肠癌的诊断和治疗具有深远的意义[2]。有证据表明抑癌基因启动子区CpG岛高度甲基化是基因失活的一个重要机制。同时在多种肿瘤组织中发现抑癌基因启动子甲基化发生频率显著增高，提示其可作为诊断结直肠癌的标志物。本文就粪便中p16INK4A、ECAD及MGMT基因启动子甲基化用于结直肠癌诊断中的临床应用价值进行探讨。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2014年2月至2015年11月我院老年病科收治的65岁以上行结肠镜检查未见器质性病变者50例(对照组)、结直肠镜病理检查证实良性结直肠疾病者41例（良性肠病组）和结直肠癌患者46例（肠癌组）为研究对象。纳入标准：(1)对照组：年龄＞65周岁；既往无结直肠疾病病史；肠镜检查未发现器质病变；排除既往有消化系统恶性肿瘤病史、其他肿瘤病史和精神疾病病史者。(2)良性肠病组：年龄＞65周岁；结肠镜检测为良性肠病，包括肠炎、结直肠息肉等；排除既往有恶性肿瘤病史和精神疾病病史者。(3)肠癌组：年龄＞65周岁；肠镜及病理学检查提示为结直肠癌；排除有精神疾病病史和有其他恶性肿瘤病史者。

1.2 仪器与试剂多功能PCR仪(DNA Engine)：BIO-RAD公司，购自美国；紫外凝胶成像系统：BIO-RAD公司，购自美国；台式离心机(AllegraX-22R)：Beckman公司，购自美国；DNAMarker DL2000，购自日本TaKaRa公司；Gold ViewTMDNA染料规格：1 mL/支，购自北京赛百盛；DNA提取试剂盒，Qiagene DNA blood minikit(50T)Qiagene；Qiagene DNA blood and tissue kit(50T)Qiagene QIAGENE公司，购自德国；亚硫酸盐修饰试剂盒，EZ DNA Methylation-Gold™Kit，Catalog Nos.D5006(200rxns)ZYMO公司，购自美国。

1.3 标本采集及DNA提取对入组患者进行粪便标本收集，取患者粪便0.5 g，根据Qiagene DNA stool minikit操作说明提取DNA。

1.4 甲基化特异PCR反应DNA碱基亚硫酸盐修饰后纯化回收，进行甲基化特异PCR反应，反应体系为：总体积为25 μL，具体为：TaKaRa Taq EX Hot Star Version(5 U/μL)0.25 μL，10×PCR Buffer(Mg2+) 2.5 μL，dNTPMixture(各2.5 mol/L)2 μL，PrimerF 0.5 μL (10 μmol/mL)，PrimerR 0.5 μL(10 μmol/mL)，模板DNA2 μL，灭菌蒸馏水17 μL，序列见表1。

表1 三个基因甲基化引物序列

1.5 统计学方法应用Stata9.0统计软件进行数据分析，计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组标本p16INK4A、MGMT和ECAD甲基化检测结果比较将PCR产物5 μL进行凝胶垂直板电泳，后行goldview染色，甲基化引物扩增有条带说明发生甲基化改变，如图1所示，肠癌组2、5、6、8、9、10及12号标本发生甲基化改变；对照组2、3、4及10号标本发生甲基化改变；良性肠病组2、6、10和12号标本发生甲基化改变。

图1 甲基化PCR电泳图

2.2 三组标本甲基化水平比较对照组、良性肠病组和肠癌组p16INK4A基因启动子DNA甲基化率分别为14.0%、24.4%和71.7%；MGMT基因甲基化率分别16.0%、14.6%和54.3%；ECAD基因甲基化率分别12.0%、19.5%和65.2%。上述基因启动子甲基化率在肠癌组显著高于对照组和良性肠病组，且差别有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 三组标本各基因甲基化水平[例(%)]

2.3 各基因甲基化诊断结直肠癌的价值分别以p16INK4A、MGMT和ECAD基因启动子DNA甲基为参考，以病理诊断为金标准，评价上述基因甲基化改变用于诊断肠癌的敏感性和特异性。p16INK4A、MGMT和ECAD诊断肠癌的敏感性分别为0.72，0.54和0.65，特异性分别为0.76、0.75和0.80，见表3。

表3 各基因甲基化诊断肠癌的敏感性和特异性(例)

3 讨论

目前，我国50岁以上老龄人口为2.56亿，占总人口19.5%，具有结直肠癌风险的人群超过1亿[3]。故高龄人群进行全面结直肠癌筛查，对于结直肠癌的早期诊断、早期治疗，提高结直肠癌的预后至关重要。但我国目前现有的卫生资源、经济条件等无法满足对所有人群进行结肠镜检查或乙状结肠镜检的要求，所以使用直接的筛查手段对高危人群进行检查并不现实。因此，探寻一种简单而敏感性较高的结直肠癌高危人群初筛指标，并根据初筛结果对阳性人群采用结直肠镜检查，这种结直肠癌筛查方法避免了盲目大规模肠镜筛查带来的弊端和可行性较差等缺点，同时也节约了医疗资源，提高了结直肠镜检查的阳性率。

近年来肿瘤的表观遗传学研究进展对结直肠癌的诊断和治疗具有深远的意义。有证据表明抑癌基因启动子区CpG岛高度甲基化是基因失活的一个重要机制，不同基因的转录失活将产生不同的后果，如影响细胞周期、DNA修复、致癌物代谢、细胞粘附、凋亡等。在多种人类恶性肿瘤中，抑癌基因启动子区CpG岛呈现不同程度的甲基化，并导致转录沉默[4-5]。已有研究显示，在结直肠癌患者中，基因启动子区的CpG岛甲基化是一个较为普遍的现象[6]。如p16INK4A[7-8]、MGMT[9-10]、ECAD基因DNA启动子甲基化在大多数结直肠癌患者肿瘤细胞中能够检测到，而基因启动子甲基化检测相对容易[11]。因此采用肠癌高危人群粪便作为研究材料，应用贝叶斯定理综合评价各种启动子甲基化模式用于诊断结直肠癌，对于提高结直肠癌的预后具有重要意义。

在本研究中笔者通过比较65岁以上健康人群、良性肠病患者及肠癌患者粪便中p16INK4A、MGMT、ECAD基因启动子的甲基化情况，探讨其作为分子标志物诊断肠癌的临床价值。研究结果认为，肠癌患者粪便中p16INK4A、MGMT、ECAD甲基化频率显著高于良性肠病组与健康人群。同时，分别以p16INK4A、MGMT和ECAD基因启动子DNA甲基为参考，以病理诊断为金标准，评价上述基因甲基化改变用于诊断肠癌的敏感性和特异性，p16INK4A、MGMT和ECAD诊断肠癌的敏感性分别为0.72、0.54和0.65，特异性分别为0.76、0.75和0.80。p16INK4A基因的敏感性和特异性均较高，ECAD和MGMT基因的特异性较高，而敏感性较低。

综上所述，综合粪便中多个抑癌基因启动子甲基化结果，有望提高结直肠癌诊断的临床效果，提高结直肠癌的早期诊断率降低结直肠癌的死亡率，整体提高结直肠癌的预后。

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Clinical value of MGMT,p16INK4Aand ECAD gene promoter methylation in the diagnosis of colorectal cancer.

FENG Kai-yu,FAN Ming-juan,TAN Rong-rong,SHEN Bo,SHI Wei,ZENG Zheng.Department of Geriatrics,Guangzhou First People's Hospital,Guangzhou 510180,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the clinical value of MGMT,p16INK4Aand ECAD gene promoter methylation in the diagnosis of colorectal cancer.MethodsFifty healthy people of more than 65 years old(control group),41 patients of benign colorectal disease(benign colorectal disease group)and 46 patients with colorectal cancer(colorectal cancer group)in Department of Geriatrics from February 2014 to November 2015 were included in this study.The methylation levels of p16INK4A,MGMT,ECAD gene promoter in the stool of the three groups were assayed by methylation specific PCR.The diagnostic value of the p16INK4A,MGMT and ECAD methylation were calculated according to the Baye's equation.ResultsThe methylation rates were 14.0%,24.4%and 71.7%for p16INK4Agene in the three groups,16.0%, 14.6%and 54.3%for MGMT gene,and 12.0%,19.5%and 65.2%for ECAD gene respectively,with statistically significant difference between colorectal cancer group and benign colorectal disease group,control group(P＜0.05).The diagnostic sensitivity was 0.72,0.54 and 0.65,respectively,and the specificity was 0.76,0.75 and 0.80 for p16INK4A, MGMT and ECAD,respectively.ConclusionThe methylation rate of p16INK4A,MGMT and ECAD gene promoter in colorectal cancer patients'stool are significantly increased,which can be used as a molecular marker for colorectal cancer diagnosis.

Stool;p16INK4A;MGMT;ECAD gene;Methylation;Colorectal cancer;Diagnosis;Sensitivity;Specificity

R735

A

1003—6350（2016）21—3461—03

2016-05-24)

广东省广州市医药卫生科技项目(编号：20151A010002)

冯凯瑜。E-mail：fengkaiyu77@163.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.21.007