李春艳， 张 桢， 赖 泳， 刘 熙， 丁 云， 刘光明（大理大学药学与化学学院药理教研室，云南大理671000）



华山松松塔提取物对人白血病、卵巢癌细胞增殖的影响

李春艳， 张 桢， 赖 泳， 刘 熙， 丁 云， 刘光明*
（大理大学药学与化学学院药理教研室，云南大理671000）

摘要：目的 研究华山松松塔提取物体外对人慢性粒细胞白血病细胞（K562）、卵巢癌细胞（SKOV3）的影响。方法采用MTT法，观察华山松松塔提取物对K562细胞、SKOV3细胞增殖的影响。结果 48 h，华山松松塔不同溶剂提取物在1 000 μg/m L时，对K562细胞、SKOV3细胞均有抑制作用（P＜0.05）；72 h，华山松松塔石油醚提取物高剂量下（1 000 μg/mL）对SKOV3细胞无抑制作用，但对K562细胞有抑制作用（P＜0.05）；氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取物在高剂量下均对K562细胞、SKOV3细胞有抑制作用（P＜0.05）。结论 华山松松塔氯仿、正丁醇、乙酸乙酯提取物均具有抑制人慢性粒细胞白血病细胞、人卵巢癌细胞增殖的作用。

关键词：华山松松塔；提取物；抗肿瘤；K562；SKOV3

松科松属植物全世界约100种，分布于北半球直达北极圈，在热带和亚热带地区只生于山地。我国有22种，10个变种，另引进16种，2个变种，合计50余种，分布极广［1］。华山松松塔系松科（Pinaceae）松属（Pinus）华山松（Pinus armandii Franch.）植物的球果，可入药。《本草纲目》记载，松塔具有祛痰、止咳平喘、祛风、润肠、安神的功效［2］。近年来，国内外已有多位学者对不同松科植物进行了研究。Sakagami H等对日本五针松（Pinus Parviflora）的化学成分和药理作用进行了研究，发现日本五针松的木质素与糖的结合体具有抗肿瘤活性［3-4］。Hiroshi Sakagami等发现赤松（Pinus densiflora Sieb.et Zucc.），湿地松（Pinuselliottii Enge1m.），火炬松

（Pinus taeda L.），加勒比松（Pinus caribaea More1et）以及樟子松（Pinus sylvestris L.var.mongo1ica Litv.）松塔中的木质素-糖复合物具有良好的体内抗肿瘤和抗菌活性［5］。此外，樟子松松塔具有抗氧化及抗炎作用［6］。国内学者的研究发现红松球果鳞片多糖具有一定的抗肿瘤活性［7］，但未见对华山松塔抗癌活性的研究，故本实验以人慢性粒细胞白血病细胞株和人卵巢癌细胞株为研究对象，初步探讨采集于云南巍山县的华山松松塔的不同溶剂提取物是否有体外抗肿瘤活性，为华山松松塔的药用开发及后续机制研究提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 材料 华山松松塔采自云南省巍山县，经大理学院夏从龙教授鉴定为松科（Pinaceae）松属华山松（Pinus armandii Franch.）的果实（松塔），样品存于大理学院药学院生药教研室的标本室。取华山松松塔10 kg，95%乙醇回流提取3次，回收乙醇得到浸膏，加水悬浮，分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚（收率为2.05%）、氯仿（收率为0.11%）、乙酸乙酯（收率为0.08%）、正丁醇提取物（收率为1.34%）。K562（人慢性粒细胞白血病细胞株）、SKOV3（人卵巢癌细胞株），均购自中国科学院昆明动物研究所。

1.2 试剂 胎牛血清（DMEM，美国Gibco公司）；0.25%胰蛋白酶、MTT（噻唑蓝）、100×双抗（Sigma公司）；DDP（顺铂）（粉针剂，山东罗欣药业股份有限公司）；羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）和二甲基亚砜（DMSO），购自美国Sigma公司；0.22 μm微孔滤膜，购自美国Mi11ipore公司。

1.3 仪器 IX-7型倒置相差显微镜（日本O1ympus公司）；连续波长酶标仪（美国Bio-Tek公司）；水套式CO2细胞培养基（美国Thermo）；YJ-1450型无菌操作台（苏州安泰空气技术有限公司）；ES-315型高压灭菌器（日本Tomykogyo公司）；96孔板（香港Nest公司）。

2 方法

2.1 样品配制 华山松松塔提取物及DDP用含10%灭活FBS的DMEM培养基超声溶解，0.22 μm微孔膜过滤，配制成1 g/L溶液。实验时，用含有10%胎牛血清的DMEM稀释成梯度质量浓度。

2.2 华山松松塔提取物对K562细胞增殖的影响［8］MTT比色法测定华山松松塔提取物对K562细胞增殖的影响。取对数生长期的K562细胞，在96孔板细胞培养板上将K562细胞悬液与不同剂量华山松松塔提取物溶液混匀，终体积为100 μL，细胞密度为1×105/mL。每个梯度设置3个复孔，同时设置阴性对照（细胞对照，未加入药物）、空白对照（空白调零孔）及DDP药物对照。37℃、5% CO2条件下分别培养48、72 h后，加入20 μL/孔MTT溶液（5 g/L），继续培养4 h后，吸走上清后，每孔分别加入150 μL DMSO，待每孔紫色结晶溶解后，Bio-Tek连续波长酶标仪测定48、72 h吸光度（D）值。测定波长为570 nm，并按下式计算按下式计算抑制率。

抑制率＝（1 -实验组平均吸光度值/对照组平均吸光度值）×100%

2.3 华山松松塔提取物对SKOV3细胞增殖的影响［8］取对数生长期的SKOV3细胞，0.25%胰酶消化后1×105/m L密度接种于96板，每孔100 μL。待细胞贴壁后，弃去上清，加入华山松松塔提取物，其终剂量分别为1 000、250、62.5、15.63、3.91、0.98 μg/mL，每个梯度设置3个复孔，同时设置阴性、空白及DDP药物对照。37℃、5% CO2条件下分别培养48、72 h后，加入20 μL/孔MTT溶液（5 mg/mL），继续培养4 h后，弃去上清后，分别加入150 μL/孔DMSO，待紫色结晶溶解后，Bio-Tek连续波长酶标仪测定48、72 h吸光度（D）值，测定波长为570 nm。抑制率计算方法同“2.2”项。

3 统计学方法

实验数据均采用SPSS 18.0统计软件进行处理，数据以±s表示，各组数据进行t检验。多组间均数比较首先采用方差齐性检验后用单因素方差分析（one-way ANVOA）进行统计学分析。

4 结果

4.1 华山松松塔提取物对K562细胞的作用 华山松松塔提取物与K562细胞共同孵育48 h后，对K562细胞增殖的影响见表1。4个华山松松塔提取物中，高剂量下（1 000 μg/mL）正丁醇提取物对K562细胞增殖的抑制作用较好（与阴性对照组比较，P＜0.01）；石油醚、氯仿、乙酸乙酯提取物在1 000 μg/mL时，对K562细胞增殖的抑制率分别为20.27%、34.80%、25.10%。72 h时，华山松松塔提取物对K562细胞的抑制率在高剂量下均比48 h大，抑制作用增强。正丁醇提取物在72 h高剂量下仍表现出很好的抑制作用，其抑制率为88.94%。石油醚、氯仿、乙酸乙酯提取物的抑制率（1 000 μg/mL时）分别为30.55%、55.25%、50.25%。随着作用时间的延长，平行剂量下的抑制作用均比48 h强，可见华山松松塔提取物对K562细胞增殖的抑制最佳时间为72 h。

表1 作用48、72 h时华山松松塔不同提取物对K 562细胞增殖作用的影响（±s，n＝3）

表1 作用48、72 h时华山松松塔不同提取物对K 562细胞增殖作用的影响（±s，n＝3）

注：与阴性对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

石油醚　　氯仿　　正丁醇　　乙酸乙酯　　石油醚　　氯仿　　正丁醇　　乙酸乙酯阴性对照组组别　　剂量/ （μg·mL-148 h抑制率/% 72 h抑制率/% ）0.00±0.26顺铂组　3.91　61.43±0.02**　55.99±0.02**华山松松　1 000　 20.27±7.05*34.80±0.94*80.17±5.72**25.10±4.52*30.55±4.40*55.25±1.39**88.94±3.20**50.52±4.17**塔提取物组　250　 5.02±7.91 18.39±0.79　 7.18±7.36　 19.97±3.88　 5.08±1.83 47.67±1.89**26.60±2.52*　48.93±1.46**62.5　 4.76±6.79　 0.00±2.67　 0.00±5.11　 15.54±4.30　 1.32±4.60　 25.75±1.15　 9.47±9.01　 45.98±4.86**15.63　 4.60±7.07　 0.00±2.71　 0.00±8.90　 8.94±5.73　 0.00±2.35　 5.98±2.96　 6.08±0.21　 17.84±3.92 3.91　 0.00±8.33　 0.00±2.91　 0.00±6.93　 8.55±1.28　 0.00±2.35　 0.00±4.03　 0.00±3.00　 14.89±8.64 0.98　 0.00±15.88　 0.00±4.23　 0.00±3.73　 8.08±4.46　 0.00±3.43　 0.00±1.42　 0.00±1.82　 4.05±3.45 -0.00±0.36

4.2 华山松松塔提取物对SKOV3的作用 华山松松塔提取48 h对人卵巢癌细胞的抑制的作用见表2。石油醚和正丁醇在（1 000～62.5）μg/mL时，对SKOV3细胞均表现出抑制作用，与阴性对照组比较，P＜0.05或P＜0.01；氯仿和乙酸乙酯提取物则在（1 000～250）μg/mL时对SKOV3细胞有抑制作用。华山松松塔的4个提取物在48 h高剂量下，对SKOV3增殖的抑制抑制率分别为43.71%、22.65%、39.79%、31.91%。72 h后，石油醚提取物在高剂量下（1 000 μg/mL）对SKOV3无抑制作用，抑制率从48 h的43.71%下降到72 h的14.96%；氯仿提取物在高剂量下仍表现出抑制作用，抑制率为21.64%，与48 h的抑制率22.65%（1 000 μg/mL时）相差不大；正丁醇提取物除在0.98 μg/mL时无抑制作用，其余剂量均表现出抑制作用（与阴性对照组比较，P＜0.05）；乙酸乙酯提取物对SKOV3增殖的影响在各剂量梯度下，随着作用时间的延长，均有抑制作用（与阴性对照组比较，P＜0.05）。

表2 作用48、72 h时华山松松塔提取物对SK 0 V3增殖作用的影响（±s，n＝3）

表2 作用48、72 h时华山松松塔提取物对SK 0 V3增殖作用的影响（±s，n＝3）

注：与阴性对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

石油醚　　氯仿　　正丁醇　　乙酸乙酯　　石油醚　　氯仿　　正丁醇　　乙酸乙酯阴性对照组组别　　剂量/ （μg·mL-148 h抑制率/% 72 h抑制率/% ）0.00±0.25顺铂组　3.91　79.82±0.03**　69.42±0.04**华山松松　1 000　 43.71±3.54**22.65±9.06*39.79±4.89*31.91±2.49*14.96±3.61 21.64±4.16*45.56±7.95**　47.04±8.12**塔提取物组　250　 43.21±3.91**21.26±6.31*32.73±3.07*20.87±3.16*　3.56±8.25 16.05±1.33 41.17±2.95**　38.02±2.24*62.5　 38.62±3.50*15.37±1.54 27.63±5.53*12.01±5.99　 2.03±0.24　 9.59±4.21 25.12±5.81*　37.90±3.31*15.63　 33.93±8.59*9.18±5.36 23.87±9.81*11.94±2.22　 0.00±3.97　 4.21±7.04 24.01±1.82*　36.54±4.83*3.91　 10.68±0.74　 0.00±2.29　 14.49±6.03　 2.55±3.26　 0.00±5.46　 0.00±9.82　 22.72±3.62*　27.41±6.21*0.98　 10.18±0.67　 0.00±7.07　 8.86±8.46　 0.00±5.74　 0.00±5.71　 0.00±3.95　 14.63±9.36　 21.91±7.01 -0.00±0.42 *

5 讨论

近年来，我国白血病的发病呈逐渐上升态势。白血病是起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，受累细胞（白血病细胞）出现增殖失控，分化障碍，凋亡受阻，大量蓄积于骨髓和其他造血组织，从而抑制骨髓正常造血功能并浸润淋巴结、肝、脾等组织器官。根据白血病的分化程度和自然病程，一般分为急性和慢性两大类。急性白血病（acute 1eukemia，AL）的分化停滞于早期阶段，多为原始细胞和早期幼稚细胞，病情发展迅速，自然病程仅数月；慢性白血病（chronic 1eukemia，CL）的分化停滞于晚期阶段，多为较成熟细胞和成熟细胞，病情相对缓慢，自然病程可达数年。根据受累的细胞系，AL可分为急性髓系白血病（acutemye1oid 1eukemia，AML）和急性淋巴细胞白血病（acute 1ymphob1astic 1eukemia，ALL）；CL分为慢性髓系白血病（chronic mye1oid 1eukemia，CML，惯称慢粒）和慢性淋巴细胞白血病（chronic 1ymphob1astic 1eukemia，CLL）［9］。慢性粒细胞白血病（chronic mye1ogenous 1eukemia，CML）是我国慢性白血病中常见的一种类型，可发生于各年龄人群。Bcr/Ab1蛋白抑制剂依马替尼（IM）是目前治疗慢性粒细胞白血病的靶点药，虽取得一定效果［10］，但存在原发及继发耐药等问题。对于复发难治患者，大多数还需接受细胞毒药物联合化疗。而细胞毒药物的严重毒副作用不但削弱了患者接受治疗的顺应性，还会严重影响患者生活质量，甚至继发其他肿瘤［11］。因此，具有抗肿瘤作用且毒副作用较小的一些非细胞毒药物引起学者们的关注。在本实验中讨论了华山松不同溶剂提取物对K562细胞增殖的影响，在48 h时，华山松松塔不同溶剂提取物高剂量下均对K562细胞有抑制作用，其中华山松松塔正丁醇提取物在高剂量下对K562细胞增殖的抑制作用较好。72 h时，随着华山松松塔提取物与K562细胞作用时间的延长，各提取物平行剂量下对其的抑制作用也相应加强，同样，华山松松塔正丁醇提取物对K562细胞增殖的抑制表现出较好的作用。

卵巢癌是女性生殖器官三大恶性肿瘤之一，其死亡率居女性生殖系统肿瘤首位。由于位于盆腔深部，缺乏有效的早期筛查方法，当患者出现明显症状时，疾病多已处于晚期，已成为严重威胁妇女生命和健康的主要肿瘤，应高度警惕［11］目前卵巢癌的标准治疗方案是以手术为主，辅以术后化疗的联合治疗，手术可行肿瘤细胞减灭术，目的是尽最大努力切除卵巢癌之原发灶和转移灶，使残余肿瘤直径小于1 cm。也可先行新辅助化疗，减少肿瘤负荷，提高手术质量［12］。卵巢癌术后化疗首选紫杉醇加铂类药物，但逐渐出现的化疗耐药已成为影响卵巢癌临床治疗效果的重要障碍［13］。中医药在卵巢癌的治疗中发挥着积极的作用，在术后及放，化疗过程中配合中医药治疗能扶助正气，保护脾胃功能，提高机体免疫力，降低化疗带来的毒副反应，减少并发症，提高生活质量及生存期［14］。对华山松的药理活性研究中，发现华山松籽油有降低TC、LDL-C及升高HDL-C的作用［15］，华山松松塔中的多糖成分具有体外抑制HIV活性［16］。但未见对华山松松塔抗肿瘤活性的报告，故本文讨论华山松松塔4个提取物对人卵巢癌增殖的影响。48 h时，华山松松塔不同溶剂提取物高剂量下对SKOV3均表现出抑制作用（与阴性对照组比较，P＜0.05），到72 h时，华山松松塔石油醚提取物对SKOV3细胞的增殖无抑制作用，华山松松塔氯仿提取物，乙酸乙酯提取物，正丁醇提取物对SKOV3细胞仍表现出抑制作用，其中华山松松塔乙酸乙酯提取物72 h的抑制作用较好。

中医药在治疗肿瘤方面，积累了丰富的经验，且疗效显著，无明显不良反应，具有多靶点，多部位，多途径，多效应的作用。通过实验发现华山松松塔4个不同溶剂提取物中，在48 h和72 h时，对K562细胞抑制作用较好的是华山松松塔正丁醇提取物；对SKOV3的抑制，48 h时华山松松塔石油醚提取物表现出较好的抑制作用，而72h时则是华山松松塔乙酸乙酯提取物抑制作用好。华山松松塔提取物后续抗肿瘤机制的研究，除对有效成分进一步分离，提取，纯化得到活性单体外，还应结合细胞实验中得出的数据，从整体药效学确证及分子药理学实验出发，寻找新的分子作用靶点，为肿瘤临床开发出生物活性高且低毒的新型中成药及中药靶向干预卵巢癌，人慢性粒性白血病和其他实体瘤打下坚实的基础。

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*通信作者：刘光明（1953—），男，硕士，教授，研究方向为中药药效学。Te1：（0872）2257412，E-mai1：1gm13330555378 @ 126.com

作者简介：李春艳（1983—），女，硕士，讲师，研究方向为中药药效学。Te1：（0872）2257412，E-mai1：1cyyanyan@126.com

基金项目：国家自然基金（81102350，81260632）；大理学院校级青年基金（KYQN2009-40）

收稿日期：2014-12-30

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.041

中图分类号：I 285.5

文献标志码：B

文章编号：1001-1528（2016）03-0668-04