何成伟，王培坤，秦丽莉，毕玉彧，邹广珍，杨永立，彭　昊，韦　平*

(1. 广西凭祥出入境检验检疫局，广西凭祥 532600；2. 广西大学养禽与禽病学研究所，广西南宁 530004)



广西凭祥斗鸡禽白血病病毒检测及分离株env基因分析

何成伟1,2，王培坤2，秦丽莉2，毕玉彧2，邹广珍2，杨永立2，彭昊2，韦平2*

(1. 广西凭祥出入境检验检疫局，广西凭祥 532600；2. 广西大学养禽与禽病学研究所，广西南宁 530004)

摘要:为了解广西凭祥市特有家禽品种斗鸡禽白血病病毒(ALV)的感染情况，采集了该市3个鸡场斗鸡的肛拭子、血清、血浆样品共344份，用禽白血病ELISA检测试剂盒进行检测。结果显示，斗鸡ALV感染情况严重，其中肛拭样品ALV-p27抗原阳性率高达39.13%，血清样品病毒分离阳性率为12.97%，ALV-J和ALV-A/B抗体阳性率分别为22.39%和7.46%；对从2只斗鸡获得的病毒分离株DJ-3-18和DJ-45进行病毒囊膜蛋白基因env的扩增、序列测定及比较分析，结果显示2株病毒的gp85基因与ALV-A亚群参考株之间氨基酸的同源性为88.2%～96.5%，gp37基因与ALV-A亚群参考株之间氨基酸的同源性为91.4%～98.0%，其中与台湾A亚群蛋鸡源分离株TW-3577的亲缘关系最近，而与ALV其他亚群毒株的同源性则较低。结果表明，首次获得的2株斗鸡源ALV分离株属A亚群。

关键词:斗鸡；禽白血病；流行病学调查；env基因；ALV-A亚群

禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)属于反转录病毒科α反转录病毒属，可引起禽的免疫抑制、生长抑制和临床肿瘤为特点的传染性致骨髓细胞瘤疾病或成髓性白血病[1]。自2000年杜岩等[2]首次报道在中国分离到J亚群禽白血病(Subgroup J of avian leukosis virus，ALV-J)以来，该病迅速在中国蔓延，众多品种鸡中相继报道分离到ALV-J[3-8]，并给我国养禽业造成巨大经济损失。

斗鸡(game fowl)体型魁梧、体质健壮结实、结构匀称紧凑、筋肉发达强健，以性强悍、善斗为基本特征。广西凭祥市位于我国西南，与越南相邻。该市的斗鸡自2005年开始从邻国越南引进后自行选择繁育，近年来斗鸡产业发展迅速，斗鸡养殖规模逐年扩大。据统计，凭祥市目前有斗鸡养殖户150户左右，年产值近亿元。在生产过程中，据养殖户反映，一些鸡个体在成年后出现内脏肿瘤而死亡，而且有逐年增多趋势。之前没有对病例进行过确诊，也没有开展过禽白血病的调查与净化工作。为了确诊这些病例，也为了了解该地区斗鸡中ALV感染情况、病毒类型与特征等，为将来可能进行的禽白血病净化与防控工作提供依据，课题组对该地区几个规模较大的斗鸡养殖场进行了流行病学调查，并对其中获得的2个分离株进行了序列分析以及遗传进化分析。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1样品本次调查选择广西凭祥市目前3个规模最大的斗鸡养殖场进行，检测样品为鸡的泄殖腔肛拭子(后面简称为肛拭子)92份、血浆185份、血清67份。

1.1.2主要试剂禽白血病病毒p27抗原试剂检测试剂盒，禽白血病病毒A/B亚群抗体、J亚群抗体检测试剂盒为北京IDEXX生物科技有限公司产品；DF-1细胞由广西大学养禽与禽病学研究所保存；基因克隆载体pUC-T、感受态Dpα细菌、2×TaqPCR Mix为北京康为世纪公司产品；DNA Marker DL 2 000为楚杰生物科技有限公司产品；胎牛血清和DMEM为GIBCO公司产品。

1.2方法

1.2.1引物设计与合成参照文献[9]设计，并交由北京华大科技有限公司合成ALV-A env基因扩增引物，env-F：5′-GGATGAGGTGACTAAGAAAG-3′，env-R：5′-ACACTACATTTCCCCCTCCCTAT-3′，扩增片段大小为2 200 bp左右。ALV-A、ALV-B、ALV-J的分型引物，参考相应文献[2, 10-11]设计合成。

1.2.2样品ELISA检测与病毒分离

1.2.2.1样品处理及检测泄殖腔肛拭子样品采集后加到检测试剂盒专门配置稀释液中冷冻保存。检测前冻融3次进行检测；血清、血浆样品则是按常规方法无菌采集，用抗体检测试剂盒分别进行A/B亚群抗体、J亚群抗体的检测。

1.2.2.2病毒分离培养选择泄殖腔肛拭子ALV-p27抗原检测呈阳性的个体及全部的公鸡个体35只，分别采集其血浆，接种DF-1细胞进行病毒分离，具体步骤参考文献[4]的方法。取0.5 mL血浆接种于长满DF-1细胞单层的培养板中，37 ℃孵育2 h后，吸弃血浆，加入含10 mL/L FBS的DMEM维持液培养3 d，更换培养基后继续维持至第9天。

1.2.2.3分离株PCR鉴定按照DNA抽提试剂盒说明书，抽提第2代细胞培养物的DNA，置-20℃保存。用ALV-A、ALV-B、ALV-J引物进行分型鉴定，用env-F、env-R进行ALV-A env 基因的扩增。

1.2.3env基因序列测定及分析对PCR鉴定为阳性的分离株用env-F和env-R引物进行env基因的PCR扩增，反应程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min 30 s，30个循环；72 ℃ 10 min；PCR产物经琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收后，与pUC-T载体22 ℃连接1 h后，将连接产物转化大肠埃希菌Dpα感受态细胞，37 ℃培养1 h后，涂LB平板培养；过夜后挑取单个菌落扩大培养，菌液提取质粒DNA，经PCR鉴定为阳性的克隆，送3个克隆样品到华大基因公司测序；利用DNA Star Lasergene 7.1软件对所获得的序列及从GenBank数据库中下载的12个参考株LR-9 (AY350569 )、HPRS-103 (Z46390)、MAV-1(L10922)、2011NDVP4(KF866225)、GXSH01( HM988993)、RSA(M37980)、SDAU09C1(HM452339)、TW3577(HM582657 )、 Schmidt-Ruppin B(AF052428 )、Prague C(J02342)、 Schmidt-Ruppin D(D10652)、ev-1(AY013303)的序列进行比较分析。

2结果

2.1样品的ELISA检测结果

肛拭子、血清样品及其病毒分离培养物上清的检测结果显示，肛拭子样品ALV-p27抗原阳性率为39.13%(36/92)；细胞培养物ALV-p27抗原阳性率12.97%(24/185)；血清样品ALV-J抗体阳性率为22.39%(15/67)；血清样品ALV-A/B抗体阳性率为7.46%(5/67)。

肛拭子样品检测ALV-p27抗原阳性率高达近40%，显著高于课题组历年对广西地区其他品种鸡进行的流调平均水平；ALV-J抗体阳性率也显著高于其他品种的平均水平；ALV-A/B抗体阳性率为7.46%，则低于其他品种的平均水平。

2.2病毒分离株PCR鉴定及env基因的扩增结果

通过ALV-A、ALV-B、ALV-J的3对亚型的特异性分型引物对分离株进行PCR鉴定，结果表明，用ALV-A引物从2个分离株样品中扩增到特异性片段(图1)，而用ALV-B、ALV-J的分型引物的扩增则没有特异性片段，说明分离到的病毒属于ALV-A。用ALV-A的env F、env R引物扩增其env基因，扩增到的目的条带约为2 200bp(图2)。2个分离株分别命名为DJ-3-18株和DJ-45株。

1. DNA 标准 DL 2 000；2. 阴性对照；3~4. A亚型的扩增；5~6. B亚型的扩增；7~8. J亚型的扩增

1. DNA Marker DL 2000；2. Negative control；3-4. Subgroup A；5-6. Subgroup B；7-8. Subgroup J

图1分离株ALV分型的PCR鉴定结果

Fig.1PCR identification results of subgroup ALV of the isolates

1.Super DNA Maker；2-3.ALV-A env

图2分离株ALV-A env基因的PCR扩增

Fig.2PCR amplification on ALV-A env gene of the isolates

2.3分离株序列的分析结果

经DNA Star软件分析，分离株DJ-3-18和DJ-45的gp85基因开放阅读框大小均为1 029 bp，编码343个氨基酸残基。与鸡的不同亚群ALV参考株同源性比较表明，2个分离株的氨基酸序列与ALV-A参考株的氨基酸序列同源性最高(88.2%～96.5%)，而与B、C、D、E、J亚群的同源性仅为36.2%～83.8%(图3)。同时，2个分离株gp85基因的氨基酸序列绘制的进化树分析表明，两分离株均与ALV-A亚型毒株同属一个分支(图4)。两分离株的gp85基因氨基酸与其他代表性参考株相比存在突变，两分离株共同拥有突变共5个，分别为D57G、R190K、V249M、T284 A和G339 D。此外，DJ-45株还出现S33A的突变。两分离株与台湾TW-3577株gp85基因氨基酸序列相近，有着较近的亲缘关系。gp37基因则相对比较保守，各ALV-A毒株gp37基因氨基酸同源性为91.4%～98.0%，未发现有缺失或插入突变。

图3　分离株与ALV各亚型病毒参考株间gp85基因氨基酸同源性比较

图4　分离株与ALV各个亚型病毒参考株gp85基因的氨基酸序列进化树

3讨论

广西是我国养禽产业较为发达的地区，且优质地方品种鸡较多。在作者所在课题组的指导与带领下，从2008年开始对该地区的几个主要大型种鸡企业开展了禽白血病和白痢(简称“两白”)的净化工作，成效显著[6]。此外本课题组对广西主要的地方品种鸡开展禽白血病病毒流行病学调查，掌握了本地区主要地方品种禽类禽白血病病毒流行情况。本研究对位于广西与越南接壤的城市-凭祥市近年来刚刚兴起的斗鸡产业开展禽白血病流行病学调查，为丰富与完善广西各种禽类禽白血病流行病学资料以及下一步禽白血病的净化与防控奠定了基础。

调查的结果显示，斗鸡感染禽白血病病毒情况比较严重。肛拭子样品ALV-p27抗原阳性率、ALV-J抗体阳性率都高于广西其他禽类的平均水平。表明该地区斗鸡产业的健康发展迫切需要对其种群进行白血病(包括白痢)的净化。广西凭祥市斗鸡饲养量较多，在全国也较为有名，许多外省客户慕名来购买。该地区目前母鸡多为自繁自养，而种公鸡则从越南引进，但均未对种鸡进行过禽白血病的检测，更谈不上净化了。因此，净化工作除了对本地区的斗鸡产业发展有必要之外，还有利于防控白血病随销售的斗鸡传播到其他地区。课题组下一步的工作之一就是指导斗鸡种鸡场开展净化工作，有效降低白血病的阳性率。

对分离到2株ALV-A毒株env基因序列分析的结果显示，两毒株与台湾蛋鸡分离株TW-3577亲缘关系最近，表明它们可能由同一个毒株衍化而来。对gp85基因核苷酸分析并与其他代表株比较，两毒株存在点突变，两分离株共同点突变有9个，其中沉默突变4个，有意义突变5个。此外毒株DJ-45 gp85基因还有一个额外的突变(S33 A)。分离株的不同位置出现的突变，对其生物学特性的影响有待于进一步研究。

目前对我国鸡群禽白血病报道主要集中于J亚群ALV，对其他亚群报道的相关文章相对较少，对当前其他亚群ALV在鸡群中流行作用也还不甚清楚。我们从广西凭祥市斗鸡中分离到两株A亚群病毒，表明我国鸡群ALV感染存在复杂性。国内有相关文章报道J亚群ALV主要是引进未经检疫种鸡时带入的[12]。本研究A亚群ALV虽是从广西凭祥市斗鸡中分离到的，但本地斗鸡的种鸡特别是种公鸡又多从外地引种。因此，我们分离到的A亚群ALV是否是通过这个渠道传入？还是是从本地鸡群传染的？这个问题的回答有助于今后对白血病的预防和控制。

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Detection of Avian Leukosis Virus in Game Fowl of Pingxiang,Guangxi and env Gene Analysis of Isolates

HE Cheng-wei1,2, WANG Pei-kun2, QIN Li-li2, BI Yu-yu2, ZOU Guang-zhen2,YANG Yong-li2, PENG Hao2, WEI Ping2

(1.Entry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Pingxiang,Guangxi,532600,China;2.InstituteofPoultryScienceandHealth,GuangxiUniversity,Nanning,Guangxi, 530004,China)

Abstract:In order to investigate the infection status of avian leukosis virus (ALV) of the game fowl in Pingxiang, Guangxi，totally 344 samples of cloaca swabs and sera were collected from three representing flocks and detected by the commercial ELISA detection kits. The results showed that the ALV infection in the game fowl was very serious with the ALV-p27 positive rate 39.13% in cloaca swabs and seral positive rate 12.97%, the positive rates of ALV-J and ALV-A/B antibodies were 22.39% and 7.46%, respectively. Two isolates DJ-3-18 and DJ-45 were recovered by culturing in DF-1 cells from two of the p27 positive birds and the env genes were amplified, sequenced and analyzed. The sequence comparison of gp85 and gp37 genes indicated that 88.2%-96.5% and 91.4%-98.0% homologies were found between the isolates and the reference strains of ALV-A subgroup, and with the highest homology with an ALV-A layer original isolate TW-3577. It is the first report of ALV-A subgroup isolated from game fowl.

Key words:game fowl；Avian leukosis；epidemiological investigation；env gene; ALV-A subgroup

文章编号:1007-5038(2016)02-0023-04

中图分类号:S852.659.3;S858.31

文献标识码:A

作者简介：何成伟(1969-)，男，广西容县人，高级兽医师，硕士，主要从事进出境动物检验检疫工作。 *通讯作者

基金项目：国家公益性(农业)行业科研专项(201203055)；国家现代农业产业技术体系广西肉鸡产业创新团队建设项目(nycytxgxcxtd-04-20-2)

收稿日期：2015-06-27