庄金秋，张颖，梅建国，王艳，苗立中

(山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600)

鸭病毒性肝炎病毒检测方法研究进展*

庄金秋，张颖，梅建国，王艳，苗立中

(山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600)

本文综述了鸭病毒性肝炎病毒的实验室检测技术研究进展，主要包括病毒分离与鉴定、血清学和分子生物学检测方法，着重介绍了目前广泛应用的中和试验、琼脂扩散试验、凝集试验、荧光抗体试验、酶联免疫吸附试验及RT-PCR、荧光定量RT-PCR技术等，比较了各种方法的优缺点和实用性，并对鸭病毒性肝炎病毒检测新技术进行了展望。

鸭病毒性肝炎病毒；检测；研究进展

鸭病毒性肝炎 （Duck viral hepatitis，DVH）俗称 “背脖病”，是由鸭病毒性肝炎病毒（Duck hepatitis virus，DHV）引起雏鸭的一种急性、高度致死性、病毒性传染病。本病以发病急、传播快、病程短、死亡率高为主要特征，临床表现痉挛、抽搐和角弓反张等神经症状，病理变化以肝肿大和出血为特征性病变。本病呈世界性分布，主要侵害4周龄以内的雏鸭，1周龄内的雏鸭死亡率可高达95%以上，严重影响着养鸭业的发展。过去曾将DHV分为3个血清型，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。目前已证实DHV-Ⅰ属于小RNA病毒科；而DHV-Ⅱ和DHV-Ⅲ均属于禽星状病毒。小RNA病毒科血清Ⅰ型可分为3个基因型，分别为基因Ⅰ型 （传统DHV-Ⅰ型）、基因Ⅱ型（台湾型）、基因Ⅲ型（韩国N-DHV型）。中国主要流行传统DHV-Ⅰ型及新型（New serotype duck hepatitis virus，N-DHV）型，二者之间无抗原相关性，没有交叉免疫保护和交叉中和作用。本病全年均可发生，同时由于血清型变异呈现的上升趋势，给疾病的诊断和防治带来了困难，给养鸭业的发展带来了严重的经济损失。本文综述了DHV的实验室检测方法研究进展，以期为疾病的快速诊断及预防和控制提供参考。

1 病毒分离与鉴定

病毒的分离培养是对DHV经常使用的鉴定方法。DHV分离技术主要有细胞培养、鸭胚（或鸡胚）尿囊腔接种和动物接种三种方法。在细胞培养方面，国外许多学者报道该病毒能在鸡胚成纤维细胞、鸭胚成纤维细胞、鸭胚肝细胞、鸭胚肾细胞和鸡胚肾细胞等多种原代细胞中生长增殖。Kaeberle等[1]（1988）用北京鸭肾细胞成功地培养的DHV，黄新民等[2]（1994）则在鸭胚肝细胞上成功的培养出了DHV。由于各毒株毒力强弱和对细胞的适应性程度不同，因此DHV在细胞上可轻微产生或不产生细胞病变。病毒初代分离一般使用鸭胚，在鸭胚中连续传几代后，容易在鸡胚中增殖。死亡鸭胚特征主要表现皮肤出血，水肿，侏儒症，肝脏肿大变绿，并有坏死灶。在随后的传代中，病死率上升，死亡特征更加明显。收集死胚尿囊液，可通过电镜技术及中和试验等方法对DHV进行鉴定。王平等[3]（1980）在DHV病例的肝细胞中看到过病毒颗粒，呈类晶格状排列，颗粒近似圆形，直径在35～40nm。程安春等[4]（1994）用胶体金免疫电镜技术和直接电镜（DEM）、免疫电镜（IEM）比较观察DHV，结果显示胶体金免疫电镜技术比DEM、IEM清晰，具有直观、灵敏的特点，但对设备的要求很高，现主要用于科研，临床诊断受到限制。

2 血清学方法

2.1 中和试验 中和试验是检测DHV最经典、可靠的方法，是目前公认的权威方法。我国各地对DVH的确诊及DHV血清型的判定大多采用此法。病毒中和实验通常在鸡胚上以固定血清-稀释病毒法进行，也有人利用鸭胚、雏鸭或病毒适应细胞中进行中和试验。Hwang等[5]（1966）对中和试验中的孵育、温度、病毒量等的最佳条件进行研究，认为被检血清在56℃条件下灭活30min，、病毒与血清的混合液在接8日龄鸡胚前37℃水浴40min可以提高检出率。Kaeberle等[1]用北京鸭肾细胞培养的DHV进行微量中和试验，既快速又易于判定。陈琨等[6]（1996）在从鸭胚得到高纯度病毒的基础上，建立了DHV-Ⅰ微量中和试验，用于免疫监测以及抗体的消长规律的测定，比一般的鸭胚中和试验更灵敏、更准确。秦智锋[7]（2002）等用鸡胚和雏鸭进行中和试验，成功制定了DVH的检疫和诊断方法。Tseng等[8]（2007）用血清交叉中和实验成功鉴别了DHV-Ⅰ与N-DHV。中和试验虽是普遍认同的权威方法，但其工作烦琐，费时，不能用于快速诊断，不适于基层推广。

2.2 凝集试验

2.2.1 间接血凝与血凝抑制试验 近年来，间接血凝试验（IHA）经过不断改进后已广泛应用于检测血清中各种病原的抗体，与ELISA相比，IHA操作过程简便、快速且不需要特殊仪器。Taylor等[9]（1967）首先报道了纯化的细胞增殖的DHV-Ⅰ被鞣酸化的绵羊红细胞致敏后进行的间接血凝抑制试验。Vashhenko等[10]（1982）检验了间接血凝试验诊断DHV-Ⅰ的效果，表明间接血凝试验与中和试验的结果符合率为90%。国内罗函禄等[11]（1990）率先报道了应用纯化的病毒抗原进行间接血凝抑制试验检测DHV抗原研制成功。孙泉云等[12]（1996）用间接血凝抑制试验与中和试验比较，阳性结果符合率为84.6%。陶海静等[13]（2007）将纯化的DHV-Ⅰ致敏双醛化红细胞制备检测DHV抗体的间接血凝诊断抗原，检测敏感性是琼脂扩散试验的32～64倍，可用于疫苗免疫后抗体水平的检测及DVH的流行病学调查。由于受非特异性凝血因子影响，以及不同批次制备的红细胞在敏感性和稳定性方面有波动，限制了IHA方法的推广应用。

2.2.2 协同凝集试验 汪铭书等[14]（1996）应用葡萄球菌A蛋白协同凝集试验 （SPA-CoA）检测DHV，对用DHV攻击死亡的雏鸭肝脏中的病毒检出率为100%。表明SPA-CoA可用于检测含DHV的病料，具有良好的敏感性和特异性。但此试验对于抗原浓度、纯度要求很高，限制了实际应用。

2.3 乳胶凝集试验 刘利芳[15]（2008）用纯化的抗DHV抗体致敏乳胶成功地建立了反向乳胶凝集试验检测DHV抗原的方法。应用结果表明，抗体致敏乳胶无自凝性，特异性强，重复性好，质量可靠。同时，其利用竞争凝集的原理，采用纯化的抗DHV-Ⅰ抗体致敏乳胶与待测血清抗体竞争结合最小抗原量，建立了竞争乳胶凝集试验检测病毒抗体的方法，该方法对抗原纯度要求不是很高，避开了DHV难以纯化的问题。试验结果表明，最小抗原量为0.02mg/ml。该方法不与其它病原反应，阻断效果明显，检测DHV-Ⅰ抗体可达1：800，比AGP试验高50倍。表明竞争乳胶凝集法检测DHV-Ⅰ抗体特异性高、敏感性强、重复性好、质量稳定、结果可靠，适合于临床流行病学调查。

2.4 琼脂扩散试验（AGP） Murty等[16]（1961）首次报道了应用AGP鉴定DHV-Ⅰ，以感染鸡胚组织制备的抗原与兔抗DHV血清进行AGP，18～24h时有沉淀线产生。孙泉云等[17]（1998）建立了AGP试验并检测了DHV抗原。许伟琦等[18]（1997）试验表明，在琼脂中加入2%PEG能加快反应速度，24h即能作结果判定，而且提高了沉淀线清晰度，而原来要48h以上才能判定结果。DHV为无囊膜病毒，张济培等[19]（2002）用不同的鸭肝炎病料，通过氯仿去脂和反透析法进行病毒的提纯浓缩，然后应用AGP试验对DHV抗原和抗体进行了检测，结果显示用抗原检测抗体或用抗体（血清）检测病毒抗原，均可达到80%的检出率。试验中还发现，试验最佳的凝胶配方为pH为7.2，NaCl为8%和琼脂糖含量为1%，病雏鸭肝浓缩抗原最为理想。AGP试验简便易行，但其特异性与灵敏度还有待提高，且AGP试验对抗原和抗体的要求严格，检测的DHV抗原需经浓缩纯化，判定结果的时间也较长，因此在临床中较难推广。

2.5 荧光抗体试验 Maiborda等[20]（1972）报道，快速准确诊断DVH的方法是接种雏鸭采用直接荧光抗体试验。我国郭玉璞等[21]（1984）应用间接荧光抗体（IFA）检测证实了北京地区流行的DVH由DHV-I引起。刘建[22]（2004）采用感染N-DHV强毒后死亡的鸭的肾细胞做滴片进行荧光染色，检测到病毒抗原存在，为临床上快速诊断N-DHV感染提供了一种检测方法。陈海军[23]（2007）建立了检测石蜡组织切片中的DHV-I抗原的IFA抗体方法。免疫荧光抗体试验虽然具有快速、灵敏、准确等特点， 但其费用和对设备的要求很高，因此目前基层很少应用该法进行DHV的检测。

2.6 酶联免疫吸附试验（ELISA） 尽管病毒中和试验是目前公认的检测DHV最权威的方法，但相比ELISA试验，在敏感性和特异性等方面均表现出其劣势。ELISA敏感、快速，已经广泛应用于DVH诊断。随着研究深入，国内外学者以原有技术为基础，相继建立了更加准确、敏感的检测DHV的ELISA方法，为鸭抗DHV血清抗体的检测以及进行DHV单克隆抗体的筛选提供了依据。

2.6.1 间接ELISA 间接ELISA法检测DHV抗体特异性高、敏感性强、重复性好、质量稳定、结果可靠，适合于临床流行病学调查。孙泉云等[24]（1997）最先以蔗糖密度梯度离心法纯化的病毒作包被抗原，建立了检测DHV抗体的间接ELISA方法。经特异性及重复性试验，效果良好。杨萍萍等[25]（2004）以氯仿去脂-滤膜过滤-浓缩层析方法纯化病毒作包被抗原，建立了检测鸡抗DHV-I型血清抗体的间接ELISA法，经交叉试验和阻断试验表明，该方法具有很高的敏感性和特异性，应用于DHV抗体检测比较有效。刘利芳[15]（2008）用纯化的DHV作为包被抗原和HRP酶标记的兔抗番鸭二抗，成功地建立了检测DHV抗体的间接ELISA法。检测DHV抗体可达1：800，灵敏度比AGP试验高50倍。冯广鹏[26]（2009）将通过鸭胚传代的病毒经过纯化后，作为包被抗原，建立了一种检测血清中 DHV抗体的间接 ELISA方法。Liu等[27]（2010）建立了VP1-ELISA检测方法来检测VP1蛋白的表达，其方法是用包被的抗原来检测鸭的DHV-Ⅰ抗体水平。与病毒的中和试验相比，VP1-ELISA不与其他病原体产生交叉反应，特异性和敏感性分别达到了92.5%和96.7%，更适用于临床大量样品的检测。孙凤萍等[28]（2011）将离心纯化后的病毒作为ELISA包被抗原，建立了检测DHV-I全病毒的间接ELISA方法，可以用于快速诊断DHV病毒感染。马秀丽等[29]（2008）以纯化的重组蛋白为抗原建立间接ELISA方法并初步应用于临床。基于全病毒建立的ELISA方法因DHV纯化比较困难而限制了该方法的推广应用。而本研究中利用大肠杆菌表达的VP1重组蛋白作为抗原建立的间接ELISA方法具有较好的敏感性，通过对80份血清样品的检测表明，该方法与中和试验的符合率为97.5%，表明其可用于雏鸭母源抗体和免疫后抗体的消长变化的检测。

2.6.2 斑点ELISA 自以硝酸纤维素膜为固相载体建立斑点ELISA（Dot-ELISA）以来，因硝酸纤维素膜吸附能力强，样品用量少，用离子型去污剂溶解的抗原亦可吸附等优点而使得此方法迅速得以推广。国内外已有许多用以检测DHV抗原抗体的报道。范伟兴等[30]（1991）首次建立了单克隆抗体Dot-ELISA法检测DHV。杨奎等[31]（1996）采用过碘酸钠法将辣根过氧化物酶标记在纯化的DHV上，将待检血清点样到硝酸纤维素膜上，用酶标记DHV建立了Dot-ELISA来检测DHV抗体，取得了良好的结果。由此建立了检测DHV抗体的斑点ELISA方法，与间接 ELISA方法的符合率达100%。严亚贤等[32]（2000）将病鸭的肝脏匀浆冻融后点于硝酸纤维素膜，建立了检测DHV抗原的Dot-ELISA。马秀丽等[33]（2004）采用过碘酸钠法以辣根过氧化物酶标记纯化的DHV-I单克隆抗体，建立了Dot-EL1SA方法。对病毒尿囊液的最低检出范围为1：16，而对肝脏病料的最低检出范围为1：160，可用于临床发病鸭的检测。黄艳艳等[34]（2007）提取和纯化了鸭瘟病毒（DPV）和DHV的抗原作为Dot-ELISA的膜载抗原，以辣根过氧化物酶标记的羊抗鸭IgG作为ELISA反应的第二抗体，建立了能够同时检测DPV和DHV抗体的Dot-ELISA方法。Dot-ELISA方法快速、敏感，且结果肉眼可见，不需要特殊的读取设备，同间接ELISA方法相比较，成本低，是一种适用于小型检测实验室使用的大规模样品检测技术。但Dot-ELISA法也有其缺点，用它检测DHV易受组织中色素的干扰，而且单抗的供应尚未商业化，其推广受到限制。

2.6.3 夹心ELISA 范伟兴等[35]（1991）首次报道了DHV单克隆抗体的研制成功，并用单抗建立了夹心ELISA法来检测DHV-I，此法能够灵敏地检测病毒样品。后经各国学者应用借鉴并逐渐完善了此类诊断技术。韩永俊[36]（2007）建立了直接检测DHV抗原的夹心ELISA法，比AGP敏感64倍，具有较好的特异性和敏感性。

2.6.4 单克隆抗体捕捉法 ELISA 孙泉云等[37]（1997）将单抗的高度特异性与ELISA的高度灵敏性结合起来，以DHV单克隆抗体包被反应板，以粗提病毒作为抗原，建立了检测DHV抗体的单抗捕捉法ELISA方法。经与间接ELISA作平行试验，二者检测符合率为100%。由于单克隆抗体能特异性地捕捉DHV抗原，即使使用粗制抗原（甚至是尿囊液毒）也能克服非特异性反应，显示出间接ELISA法无可替代的优势，因此该方法的优点在于可免去DHV-I的复杂提纯工作，便于推广应用。

2.7 胶体金技术 程安春等[4]（1994）将DHV-I样品与兔抗DHV-I抗体混合作用后13000r/min离心，取沉淀用双蒸水悬浮后加入胶体金羊抗兔IgG，37℃作用30min，再次离心取沉淀用双蒸水悬浮，滴于铜网，用3%、pH6.5～7.0的磷钨酸负染，干燥后镜检。结果在电镜视野中观察到大量的单个DHV病毒粒子。表明胶体金免疫电镜技术可用于检测DHV-I，而且具有简便、快速、灵敏、直观等特点，但胶体金法成本高，限制了该方法的推广应用。张小飞等[38]（1997）用胶体金标记提纯后的兔抗DHV的IgG，建立了一种以微孔滤膜为固相载体，以红色胶体金为标记物来检测DHV的斑点免疫金渗滤法（DIGFA）。该法既可定性，亦可定量，对纯化DHV的最小检测量为4.12ng/点，其敏感性为抗原斑点试验（AST）的2倍。特异性阻断试验和交叉反应试验证明用DIGFA检测DHV具有较高特异性。对DHV鸡胚尿囊液的检出率为100%，对36份临床样本检测的阳性率为83.3%。但是目前在应用DIGFA法检测肝脏等病料时，因有血色素在滤膜上沉淀，严重干扰了结果判定。

2.8 免疫组化法 免疫组织化学法是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行定性、定位的一种检测方法，经过组织化学的显色反应呈现醒目的阳性色彩，用显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察。张小飞等[39]（2005）以鼠抗DHV抗体为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，建立了检测石蜡切片中DHV抗原的免疫酶组化法，并以此对人工感染雏鸭的不同组织器官中的DHV做精确定位和分布测定，为探讨DVH的致病机理提供依据。陈海军[23]（2007）以蔗糖密度梯度离心提纯的DHV-I免疫兔制备兔抗DHVI抗体，建立了检测石蜡组织切片中DHV-I抗原的间接免疫酶染色法（IIS），并对DHV-I强毒人工感染死亡或濒死雏鸭的各个组织器官进行了检测。结果表明该IIS法具有良好的特异性，为DHV-I感染的实验室诊断、感染鸭体内DHV-I抗原亚细胞定位的研究提供了有效的检测手段。

3 分子生物学方法

3.1 RT-PCR PCR具有灵敏度高、快速、特异、操作简单等优点，随着人们对DHV基因组序列的不断研究，RT-PCR已被广泛应用于DHV病原的检测。Kim等[40]（2006）、马秀丽等[41]（2006）、程安春等[42]（2007）、华炯钢等[43]（2007）、张丽等[44]（2008）、关育芳等[45]（2008）、刘艳萍等[46]（2008）、邵泽香等[47]（2009）、Cheng等[48]（2009）、钮慧敏等[49]（2011）先后根据DHV保守区设计物，建立了检测DHV-Ⅰ型的RT-PCR方法。为DHV-Ⅰ的分离鉴定、临床病料的检测和分子流行病学调查奠定了基础，也为有效防治DVH提供了科学依据，同时对减少经济损失也具有重要的现实意义。 何冉娅等[50]（2009）、宋永峰等[51]（2009）、魏雪涛等[52]（2010）先后建立了DHV-Ⅰ型和N-DHV型的鉴别RT-PCR检测方法，为两种病毒的鉴别诊断提供了可靠的理论依据。

3.2 套式RT-PCR 罗玉均等[53]（2007）、蒙秋[54]（2007）、黄显明等[55]（2008）、黄成斌等[56]（2009）、李娇等[57]（2011）先后建立了检测DHV-I的套式RTPCR方法，可用于DVH-I的早期诊断、临床病料检测和分子流行病学调查等。陈琳琳[58]（2013）、柴顺秀等[59]（2013）、李娇等[60]（2013）先后建立了DHV-Ⅰ型和N-DHV型的鉴别双重RT-PCR检测方法可用于DHV的快速分型和鉴别检测。

3.3 荧光定量RT-PCR 罗玉均等[61]（2008）建立了检测DHV-I的SYBR GreenⅠ荧光定量RTPCR方法。杨苗[62]（2009）根据DHV-I 3D区域序列设计引物和TaqMan TM探针，建立了荧光定量RT-PCR方法。应用该方法对DHV-I强毒在鸭胚内的分布规律和弱毒在鸡胚内的分布规律进行了研究，定量检测人工感染DHV-I的雏鸭体内病毒动态分布情况，定量检测感染DHV-I强毒后耐过雏鸭的病毒排泄规律，并对四川部分鸭场的健康鸭群和养鸭环境进行了流行病学调查。

3.4 PCR-ELISA 刘艳萍[63]（2014）、耿昕颖等[64]（2016）先后根据DHV-I VP1基因，设计合成生物素及地高辛标记的引物及探针，成功建立DHV PCRELISA检测方法，其敏感度比常规PCR高100倍。该PCR-ELISA方法具有特异、敏感、安全的特点，为DVH的流行病学研究及病原检测提供了新的途径。

3.5 其它生物学方法 在PCR检测法不断创新的同时，其他分子生物学的方法也不断推出。杨奎[31]（1996）利用构建的 DHV cDNA文库制备了cDNA探针，用于检测DHV，其敏感性比Dot-ELISA高200倍，探针能与DHV不同毒株的核酸杂交，病毒检出量达lpg水平。Huang等[65]（2011）建立了基于椭圆偏振法的生物传感器检测DHV-I病毒的新型方法。它将DHV-I的多克隆抗体固定后，通过一种蛋白质来捕获样品中的病毒颗粒。检测结果显示这种技术较传统检测方法更加便捷、敏感，在 DHV检测上有很好的应用前景。Song等[66]（2012）通过使用DHV-I高保守的3D基因，建立了逆转录环介导等温核酸扩增技术 （RT-LAMP），对DHV-I病毒的检出量是1.45pgRNA。同时证实了使用RT-LAMP检测出的受感染样品中DHV-I RNA的安全性很高。RT-LAMP检测方法具有高灵敏度、特异性、快速且容易肉眼观察到最终产物等优点，它的建立为检测和监督DHV-1病毒提供了新方法。董航等[67]（2016）建立了检测DHV的核酸序列依赖性扩增技术（NASBA），相对于常规的RT-PCR方法，NASBA检测不需要扩增仪且用时更短，实际操作也更易被人们接受，也便于其在基层推广。该方法为DVH的诊断提供了新的技术支持。

4 前景与展望

DVH致病性高，传播速度快，是20世纪以来危害雏鸭最为严重的传染病之一，给我国养鸭业带来了巨大的经济损失。通过疫苗接种雏鸭可避免该病的发生，如果已经发病可用高免血清或高免卵黄抗体进行治疗，可有效控制病情。有效地防控DVH的暴发与蔓延关键在于早期快速、敏感和特异的诊断，但近年来我国DHV-I及其变异株广泛流行，给疾病防控诊断带来了很大困难。综上所述，可用于DVH诊断的方法虽很多，然而目前公认的最常用、最可靠的实验室诊断方法仍属中和试验。但因其操作复杂、费时、成本高，不能用于快速诊断，故不适于基层的推广应用。由于DHV抗原提纯困难，许多实验室诊断方法难以得到实际应用，如IHA、AGP等。免疫荧光抗体检测虽然具有快速、灵敏、准确等特点，但因其对费用和设备的要求高，临床上难以推广。ELISA法虽有简便、快速、特异性强等优点，但仍需进一步提高抗原纯度，加速单克隆抗体的研发，并使之商业化。近年来分子生物学技术，特别是PCR及荧光定量PCR技术得到了飞速发展，已被广泛应用于DHV病原的检测。相信随着DHV全基因序列的破译，通过分子生物学研究，将基因工程技术运用到免疫学检测方法中，加快开发建立和制定行之有效的标准化免疫诊断程序，建立一套完整、有效、快速的检测方法将会作为以后DHV流行病学检测和诊断的主要方法，具有更为广阔的应用前景和理想价值，从而促进我国DVH防控事业的健康、快速、持续发展。

1～67省略，如有需要请与杂志社联系）。

S858.324.4+3

A

1673-1085（2016）09-0052-05

2016-08-20

山东省现代农业产业技术体系家禽创新团队项目 （SDAIT-11-16）；滨州市科技发展计划项目（2015ZC0109）

庄金秋（1978-），女，山东潍坊人，兽医硕士，副研究员，主要从事细胞培养和动物用病毒疫苗研制。