冯嘉轩，赵永坤，孟繁平，吴泽民，刘　智，李　娜，刘　全



弓形虫病诊断方法研究进展

冯嘉轩，赵永坤，孟繁平，吴泽民，刘智，李娜，刘全

［摘要］弓形虫病是由弓形虫感染引起的一种严重的人兽共患寄生虫病，对人类健康造成极大威胁。本文对弓形虫病诊断技术，包括不依赖DNA检测诊断方法、血清学检测以及基于寄生虫核酸的分子生物学方法进行综述，为弓形虫病诊断技术和方法的发展提供新的思路。

［关键词］弓形虫病；分子生物学；诊断

DOI∶ 10.3969/j.issn.1007-8134.2016.03.004

弓形虫是可以感染包括人在内的绝大多数温血动物的专性细胞内寄生虫，属于顶端复合物亚门、孢子虫纲、真球虫目、弓形虫科、弓形虫属。弓形虫生活史分为速殖子（又称滋养体）、包囊、裂殖体、配子体和卵囊，前3期为无性生殖，后2期为有性生殖，仅在终宿主肠黏膜上皮细胞内发育造成局部感染。一般情况下，人感染弓形虫后无明显症状，但是免疫力低下或患免疫功能缺陷病时，可引起弓形虫病。弓形虫病是一种重要的人兽共患寄生虫病，具有流行范围广、感染率较高、临床症状复杂等特点，全世界约有20亿人感染过弓形虫，对人类健康造成极大威胁［1-3］。

弓形虫病分为先天性弓形虫病和获得性弓形虫病。患病的孕妇通过胎盘屏障将弓形虫传染给胎儿，妊娠早期感染可导致流产、畸形、死胎等，妊娠晚期可导致新生儿隐性感染，新生儿出生时即可出现脑内病变、消化道症状和皮肤症状等。虽然患先天性弓形虫病的新生儿存活率较高，但绝大多数伴精神发育障碍、视力发育障碍甚至运动障碍，患病新生儿最常见的死亡原因是融合性肺炎［4-5］。获得性弓形虫病是由于食用半生或全生的含有弓形虫包囊的肉类食品，与宠物（主要是猫）或家畜家禽密切接触后，弓形虫可经黏膜和损伤皮肤进入人体。获得性弓形虫病病情轻重不一，淋巴结肿大在免疫功能正常的患者中最为多见，免疫缺陷者如AIDS和恶性肿瘤患者等常有显著全身症状如高热、全身疼痛、呕吐甚至合并脑炎、心肌炎等，最严重可导致死亡［6］。

弓形虫病对人类健康、优生优育、公共卫生及畜牧业发展都有极大的威胁，对弓形虫检测及诊断的研究愈发受到关注，本文对此进行综述。

1　病原学诊断

1.1显微镜镜检传统显微镜可检测到粪便、水、环境和组织样本中的弓形虫，但灵敏度低，结果可靠性不高。粪便、水和环境中的卵囊须从大量样本中过滤之后才能进行显微镜观察。组织样本中的包囊可直接通过染色与宿主细胞鉴别，吉姆萨染色和HE染色通常为染色包囊的主要方法，简便有效；糖原染色可将裂殖子的支链淀粉酶颗粒染色，但相对费时，同时要求操作熟练才能得到比较满意的结果。此外，电镜可直接检测到小鼠大脑内和猫小肠组织的包囊，但该法不适用于常规检测［7-8］。

1.2动物接种通过实验动物对弓形虫进行分离鉴定是弓形虫病诊断的“金标准”，小鼠和猫是分离弓形虫常用的实验动物［9］，分泌物、排泄物、血液、淋巴结、肌肉和脑组织都是须要独立检测的样本。为提高分离鉴定的成功率，常采用对弓形虫更具有易感性的INF-γ基因敲除小鼠，或通过自由饮用地塞米松的方式对正常小鼠进行免疫抑制。猫的肌肉组织中可检测到少量有活性的弓形虫。虽然通过动物接种诊断弓形虫的方法可靠性高，但由于检测周期较长，不适用于大量样本筛查。

2　影像学诊断

成像技术包括CT、MRI和超声波，成像技术便于诊断弓形虫病定位病灶，可作为辅助诊断弓形虫病的方法，但监测治疗效果不具有特异性［10］。CT可对免疫缺陷患者感染弓形虫后发生脑炎和脑脓肿进行最初步的检测，也可检测弓形虫病婴儿弥散性脑积水和脑钙化。MRI常用于检测损伤程度及范围。超声波是先天性弓形虫病产前诊断的重要方法之一。

3　血清学诊断

多数个体在感染弓形虫时无明显特异性的临床表现，诊断多依靠血清学检测。不同的血清学检测方法可用于检测不同的抗原或抗体。IgM可检测出1周到几个月甚至数年的感染，所以不能作为急性感染的有效指标；IgA检测比IgM出现更早，可以持续几个月，因此可以作为急性感染的诊断指标；IgE出现的时间较短，可做为正在感染期间的判断标准；IgG的出现只能提示有感染发生，但是不能确定感染时间［11-12］。

3.1染色试验（dye test， DT）DT可称为最经典的特异性血清方法，速殖子在有致活因子的参与下与样本的特异性抗体发生作用，导致虫体表面膜被破坏，可被美兰染色。镜检虫体被蓝染为阴性，反之为阳性。但其主要缺点是必须要求活的寄生虫体和健康人血清，具有较高的危险性，检测具有一定的局限性［13］。DT过程中使用细胞培养的方式获得速殖子，会出现一定比例的假阴性结果，因此直接从小鼠体内获得速殖子具有准确性。

3.2酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）ELISA由于操作简便，可用于大规模样本的自动检测，反应体系包括固相的抗原或抗体、酶标的抗原或抗体及酶反应底物。ELISA主要分为3类：①间接ELISA，该方法可检测到抗弓形虫IgG、IgM和IgA，常用的包被抗原是速殖子裂解抗原（tachyzoite lysate antigen， TLA）。随着技术的不断改进，将精确的抗原与蛋白质重组并标准化形成重组蛋白，可在大肠杆菌及酵母中表达，抗原种类包括致密性颗粒抗原（GRA1、GRA2、GRA4、GRA6、GRA7和 GRA8）、弓形虫棒状体蛋白（ROP1和ROP2）、基质蛋白MAG1、微线体蛋白（MIC2、MIC3、MIC4和MIC5）以及表面抗原（SAG1和SAG2）［14-19］。重组抗原的结果与单一抗原比较，更具敏感性和特异性。例如SAG2A、GRA2、GRA4、ROP2、GRA8和GRA7可用于检测人体由于近期感染出现的IgG；ROP1、SAG1、GRA7、GRA8和GRA6可检测IgM；GRA7和GRA8可检测IgA。②双抗体夹心法ELISA，可检测弓形虫循环抗原，使用TLA的双抗体夹心ELISA检测人体内的IgM比间接荧光抗体试验法更敏感，急性感染时使用P35检测IgM比使用TLA更有特异性。使用由2个不同物种制备的抗MIC10抗体检测MIC10循环抗原，可为早期弓形虫病提供诊断依据［20-21］。③Dot-ELISA法，抗原抗体结合在聚苯乙烯板的硝酸纤维膜上，与常规ELISA相比操作更简单，无需特殊仪器。

3.3改良凝集试验（modified agglutination test，MAT）在MAT过程中，速殖子使用福尔马林固定，将其加入U型微量滴定板中，再加入稀释过的待测血清进行检测。若在滴定孔中出现一层薄薄的片状凝集物质，血清样本测定结果为阳性；在孔底部出现由速殖子形成的致密颗粒沉淀，则结果为阴性。由于寄生虫表面粘附有正常的IgM，会导致MAT的敏感性和特异性降低，所以在实验过程中须向缓冲液中加入2-巯基乙醇，去除抗原表面非特异性的IgM［22-23］。通过MAT可检测到大多数种属宿主的IgG抗体，但是急性感染发生的早期可能出现假阴性结果。MAT操作简便，与DT相比更具有特异性和敏感性，广泛应用于实验室诊断及流行病学调查。

3.4乳胶凝集试验（latex agglutination test， LAT）LAT是将乳胶颗粒包被可溶性抗原，并加入待检测血清中观察凝集现象，若感染弓形虫则会出现凝集反应。LAT可方便快速地检测抗弓形虫IgG抗体，通常做为一种流行病学的筛查方法。若出现阳性结果，则需要其他血清学检测以便进一步检查。

改良LAT可检测抗弓形虫IgM抗体，由此判断是否在近期感染弓形虫。分离出微粒体抗原Sp-2可与抗弓形虫抗体结合，与IgG和IgM的反应随浓度不同产生变化，只有当乳胶颗粒浓度≤100 μg/mg抗原时，Sp-2抗原与IgM结合发生反应［24］。根据该抗原的独特反应，可以利用蛋白酶-K处理的抗原包被的微粒建立LAT检测人体IgM抗体，可有效排除IgG抗体、风湿因子或抗核抗体的干扰［25］。

3.5间接血凝试验（indirect hemagglutination test，IHA）将抗体包被于红细胞表面，成为致敏的载体，然后与弓形虫的可溶性抗原结合并发生凝血，即为阳性。IHA对弓形虫急性感染和先天性感染比较不敏感，但IgG-IHA检测简单快速，因此广泛应用于流行病学调查。通过建立IgM-IHA检测模型，将弓形虫可溶、碱性且具有热稳定性提取物包被于成熟稳定的人类红细胞，将该模型用于人类急性弓形虫病的血清学检测，其灵敏度达到100％，特异性达到98.5％［26］。

3.6间接荧光抗体试验（indirect fluorescent antibody test， IFAT）IFAT是检测IgG和IgM抗体的简易试验，并广泛应用于检测人及动物的弓形虫抗体。将已失去活性的弓形虫速殖子置于血清中进行培养，加入荧光抗物种抗体，通过荧光显微镜下观察结果。结果提示其灵敏度为80.4％～100％，特异度为91.4％～95.8％。荧光标记的抗体在不同物种之间可以通用，该方法相对比较便宜，但是肉眼观察可能导致结果有一定偏差［27-28］。

3.7免疫吸附凝集试验（immunosorbent agglutination assay， ISAGA）抗人IgM抗体包被微量滴定板，加入血清37 ℃孵育2 h，洗板后加入速殖子悬浊液，在37 ℃潮湿温室中孵育过夜。人血清中的特异性IgM与抗人IgM和寄生虫粘附固定抗原结合，该法比IgM-ELISA更简便易行，但要求大量的弓形虫速殖子［29］。IgM-ISAGA通过使用弓形虫速殖子代替乳胶颗粒包被可溶性抗原，可用于诊断弓形虫急性感染和先天性感染。

3.8免 疫层析 法（immunochromatographic test，ICT）该法通过胶体金标记抗原或抗体作为示踪物，并使用纤维素膜作为固体支撑。待检测的抗原或抗体滴在硝酸纤维膜的样品板上，通过虹吸现象缓慢渗透共轭垫，抗原抗体复合物呈现出胶体金反应。在弓形虫急性感染早期（2～4 d）可使用胶体金交联的抗排泄/分泌物抗原IgG抗体进行快速ICT［12］。与ELISA相比结果具有一致的敏感性和特异性，操作简便快速，无需特殊仪器，适合广泛应用。

3.9蛋白免疫印迹试验（western-blotting， WB）WB是血清与弓形虫抗体在膜上发生反应后转移到聚丙烯酰胺凝胶上，产生的条带与已知的分子量相比对而得到结果。WB灵敏度达到100％，检测人唾液中的特异性抗弓形虫IgG抗体的特异度可达98.5％，但对于弓形虫视网膜炎症的特异性诊断低于83.0％。WB是一种有效的补充诊断方法，用于新生儿先天性弓形虫病诊断。如IgA与IgM的ELISA、IgG与IgM的WB两者结合，分别具有94％、94％和100％的灵敏度［30］。

3.10亲和力试验 寄生虫感染后产生抗弓形虫IgG，不能确定感染具体时间，抗弓形虫IgM抗体不能作为急性感染的精确标准，IgA也不能作为急性阶段的特异性标志物。Hedman等［31］描述的IgG亲和力试验被广泛应用于鉴别急性和慢性弓形虫感染。弓形虫抗原的特异性抗体的亲和力在不同感染时期有所不同。在早期感染时，亲和力随感染病程而上升，因此可用于区分慢性和急性感染。该试验适合于不同的血清学试验过程中检测IgG、IgM和IgA，但具有一定限制性，如妊娠妇女检测弓形虫特异性IgG亲和力较低，可能与怀孕期间对弓形虫的治疗有关［32］。

4　基于检测寄生虫核酸的分子生物学诊断

分子生物学诊断通常作为血清学检测弓形虫病之外的检测方法，常规方法虽然正确率较高，但是对产前诊断和免疫缺陷患者的诊断具有一定限制性。如妊娠妇女可能通过血清学确诊感染弓形虫，此时胎儿被感染的潜在几率增加，但是血清学结果并不能确定寄生虫是否通过母婴传播导致胎儿感染，而分子生物学方法可对胎儿是否感染弓形虫进行准确诊断。

4.1常规PCR由于传统诊断方法的内在限制，PCR是除血清学之外诊断弓形虫病的重要方法之一。PCR可以进行有效体外酶扩增，在较短时间内通过微量原料特异性扩增出DNA片段。生物样本检测弓形虫感染常用的拷贝目的基因包括B1基因、529 bp的重复序列、内部转录间隔序列（ITS-1）和18S rDNA序列。当出现寄生虫血症时，对血液样本进行PCR意义不大，SAG1、SAG2和GRA1等单拷贝基因也可作为PCR的目的基因。

检测弓形虫B1基因被广泛应用于先天性弓形虫病的产前检测以及免疫缺陷患者的弓形虫感染。将529 bp的重复序列扩增10～100次后进行检测，比单纯检测B1基因更敏感［33-34］。在极少数实验中，多拷贝ITS-1和18S rDNA也可以作为靶基因，与B1基因的敏感性相似。巢式PCR针对B1基因、529 bp和ITS-1序列检测时，建立2个连续PCR体系所使用的2组不同引物，并且使用第1次PCR的反应产物作为第2次PCR反应模板，其检测结果与常规PCR检测相比较，更具有敏感性和特异性。巢式PCR对529 bp重复片段的检测极限是640 fg的寄生虫DNA，对B1基因最小为5.12 pg，巢式PCR对B1基因的灵敏度高于ITS-1［35］。

4.2实时聚合酶链反应（real-time PCR，RTPCR） RT-PCR可检测到低浓度的靶DNA并且定量正在复制的特异性DNA模板，在每个循环通过探针和嵌合染料可检测到扩增产物，可通过标准已知浓度进行定量。RT-PCR可对人的血液、脑脊液、羊水、房水及其他样本检测，还可用于评估弓形虫病进程和治疗效果，以及弓形虫感染强度［36-38］。与常规PCR和巢式PCR相比，RT-PCR检测B1基因是诊断先天性弓形虫病表现最好的技术。由于其是一个快速封闭的管状系统，RT-PCR可消除污染对定量结果的影响，因此适于标准化校准。

Opsteegh等［39］发明一种磁力捕获特异性序列的方法，可从不同组织分布的弓形虫组织包囊这样的大组织样本中定位弓形虫DNA，也可通过微量样本进行检测，这项技术结合RT-PCR可用于肉类样本检测，评估弓形虫感染食源性动物的不同组织的干扰因素。

4.3环介导等温扩增法（loop-mediated isothermal amplification， LAMP） LAMP是一种特殊的DNA扩增技术，在等温条件下用4种引物识别靶基因的6个区域。该法灵敏度略高于常规PCR，略低于RT-PCR［40］。LAMP可从人类和动物样本以及水样本中定位弓形虫基因如SAG1、29-bp重复序列、B1、SAG2、GRA1、卵囊壁蛋白（oocyst wall protein， OWP）基因和18S rRNA［41］。LAMP可以在感染弓形虫2 d猪的血液样本中检测出弓形虫DNA，该方法可用于弓形虫病的早期诊断。B1-LAMP和OWP-LAMP检测阈值极低，LAMP在人血样本和水样本检测弓形虫时通常定位SAG1、SAG2和 B1基因。由于LAMP只要求水浴或加热器，能目测到扩增产物，可在没有精密复杂的昂贵仪器时做为一种诊断替代方法。但是就目前而言，LAMP似乎极易被污染，因此严格的质量控制是降低假阳性的基本标准。

5　小　　结

显微镜检查和活体检查是针对弓形虫检查的“金标准”，虽然准确性高，但比较费时费力，不便于大样本筛查。临床上更多应用血清学检测方法检测弓形虫特异性抗体或循环抗原，具有较高的准确性，操作简便快捷，临床上经常使用，也适用于流行病学调查。在诊断弓形虫病的方法中，分子生物学方法最为标准化，也比较客观，是近年来持续研究与发展的热点。了解弓形虫基因组、转录组和蛋白质组学技术和基因及血清学分型法，对调查弓形虫的遗传特性有着至关重要的作用。综合运用分子生物学和生物技术，可能为诊断弓形虫病提供全新的思路。

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（2015-11-11收稿 2015-12-28修回）

（责任编委 曲 芬 本文编辑 陈玉琪）

［文献标志码］［中国图书资料分类号］ R531.8 A

［文章编号］1007-8134（2016）03-0139-05

*Corresponding author， E-mail： liuquan1973@hotmail.com

［基金项目］公益性行业（农业）科研专项（201303042）

［作者单位 ］130117，长春中医药大学基础医学院实验教学中心（冯嘉轩、吴泽民、刘智），生物教研室（李娜）；130122 长春，军事医学科学院军事兽医研究所病毒学研究室（赵永坤），寄生虫病研究室 吉林省人畜共患病预防与控制重点实验室（刘全）；133002，延边大学医学院免疫与病原微生物教研室（孟繁平）

［通讯作者］刘全，E-mail∶ liuquan1973@hotmail.com

Advances in diagnostic techniques of toxoplasmosis

FENG Jia-xuan， ZHAO Yong-kun， MENG Fan-ping， WU Ze-min， LIU Zhi， LI Na， LIU Quan*
Center of Experimental Teaching， College of Basic Medicine， Changchun University of Chinese Medicine， Changchun， Jilin 130117， China

［Abstract］Toxoplasmosis is a severe parasitic zoonosis caused by Toxoplasma gondii， which poses a threat to human health. In this paper， the diagnostic techniques of toxoplasmosis and detection methods of T. gondii were reviewed， including non-DNA-based diagnostic methods， serological assays， and molecular methods based on detection of parasite nucleic acid in hope of providing an insight into the development of novel diagnostic technologies and methods of toxoplasmosis.

［Key words］toxoplasmosis； molecular biology； diagnosis