王 欢,王庆甫,殷岳杉,张 栋,王伟利,丁昊彬,郭玉茹,杜汪洋,甘 稳,徐铭康

(1.北京中医药大学，北京 100029；2.北京中医药大学第三附属医院，北京 100029)



Toll样受体在骨关节炎中的作用研究新进展

王 欢1,王庆甫2*,殷岳杉2,张 栋1,王伟利1,丁昊彬1,郭玉茹1,杜汪洋1,甘 稳1,徐铭康1

(1.北京中医药大学，北京 100029；2.北京中医药大学第三附属医院，北京 100029)

Toll样受体(TLRs)是固有免疫系统中一类重要的模式识别受体(PRRs)，通过对不同病原相关分子模式(PAMPs)和内源性危险信号相关分子模式(DAMPs)的识别，触发髓样分化因子88(MyD88)依赖和非依赖途径，激活NF-κB信号转导通路，引起细胞因子和炎性介质的分泌，启动固有免疫应答，在骨关节炎的进程中发挥着重要的作用。研究TLR家族分子及其介导的NF-κB信号转导通路及其在OA中的作用，对进一步阐明OA发生发展机制、提供更有效的预防及治疗方案提供理论依据。

Toll样受体；骨关节炎；NF-κB信号通路

骨性关节炎(Osteoarthritis,OA)是以关节软骨退行性改变和骨质增生为主要特征的慢性疾病，伴软骨下骨变性、骨赘形成及滑膜炎症[1]。其具体发病机制尚未完全阐明，但最新研究表明，固有免疫应答在OA的发生与发展过程中起到关键的作用[2]。其中，Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)是固有免疫系统中一类重要的模式识别受体(PRRs)，广泛参与病原相关分子模式(PAMPs)的识别及内源性危险信号相关分子模式(DAMPs)的感知，进而启动固有免疫应答[3]。笔者就TLR家族分子及其介导的NF-κB信号转导通路及其在OA病理机制中的研究进展作一综述。

1 TLRs的生物学特征

20世纪末，随着第一个TLR的发现，人们对TLRs及其相关的固有免疫的研究开启了一个新时代。LEMALTRE等于1996年发现toll是一种对只有先天免疫的果蝇宿主防御真菌感染的关键受体[4]。MEDZHITOV.R 等于1997 年发现一个哺乳动物Toll样受体的同系物(现在命名为TLR4)可诱导炎症反应相关基因的表达[5]，因与果蝇胚胎发育过程中的Toll基因有关，因此取名为Toll样受体。到目前为止，已有13个TLRs成员被确定发现，其中，TLR1 至TLR10在人类均有表达[6]，TLRs是一种相对分子质量在90～15O kDa之间的PRRs,作为膜结合糖蛋白受体，所有的TLRs同源分子均属守恒的I型跨膜蛋白，由N端胞外配体识别区、跨膜区和C端胞内信号区3个主要部分组成。其中，胞外区成弯曲的马鞍状，由16～28个富亮氨酸重复序列(leucine-rich repeats,LRRs)构成，为配体识别部位,主要行使识别PAMPs和DAMPs的功能；跨膜区主要由大约20个不带电的不规则伸展的疏水残基构成,与包膜结合固定受体，一般认为，此区的结构域对决定TLRs分子的亚细胞定位和分子特性起决定性作用[7]。胞内信号区因与IL-1受体高度同源，也被称为Toll/IL-1受体同源结构域(Toll/interleukin-1 receptor domain，TIR结构域)，借其嗜同性作用募集下游含有TIR的信号转接蛋白进入细胞内，介导其间相互作用并组成蛋白-蛋白信号复合体[8]。

不同的TLRs能通过识别几近涵盖全部人类可遇病原体及产物的PAMP或DAMP,获得固有免疫。例如，作为重要的模式识别受体的成员，TLR-2的识别范围较广，其配体主要包括外源性配体如G+菌细胞壁肽聚糖和脂磷壁酸(LTA)、某些细菌及支原体的脂蛋白或圆柱形脂多肽(lipopeptides，LPS)、分枝菌属的阿拉伯糖甘露糖脂(lipoarabinomannan，LAM)、糖基、及酵母菌的酵母多糖(Zymosan)等；亦可识别内源性 DAMPs 配体如透明质酸(hyaluronic acid,HA)、高迁移率族蛋白-1(HMGB-1)及热休克蛋白以等[12]。值得一提的是 TLR2 还可以与非TLRs的分子结合，如：巨噬细胞内源性的蛋白、热休克蛋白、脂多糖及胞壁酸等。而TLR4作为最早被发现的TLR家族成员，是介导革兰氏阴性菌脂多糖(lipopeptides，LPS)应答最主要的天然配体，它们不能直接识别结合细菌LPS，但与LPS活化信号的转导密切相关。同时,其可识别的外源性配体还有植物双萜紫杉醇、呼吸道合胞体病毒F蛋白(respiratory syncytial virus protein F,RSF)、LTA、乳腺肿瘤病毒包膜蛋白等，内源性配体主要包括由宿主的坏死细胞释放的热休克蛋白(heatshockproteins，HSP)、HMGB-1、纤连蛋白(fibronectin，FN)、细胞外基质(extracellular matrixc,ECM) 组分等[8]。

2 TLRs介导的NF-κB信号转导通路

不同的TLR分子识别配体后与其结合，以配二聚体聚复合物的形式将含TIR的衔接蛋白募集至TIR区，进而根据所募集衔接蛋白的不同，通过启动细胞内的下游级联反应，有选择性的激活相应信号转导途径，产生由TLRs介导的各种特异性生物学效应。TLRs因跟相应衔接蛋白的特异性结合而具有各自的特点[9]。Toll样受体介导的信号通路包括以下不同的转接蛋白,包括髓样分化因子88(Myeloiddifferentiation factor 88,MyD88)、IL-1受体相关蛋白激酶(IL-1 receptor-associated kinase，IRAK)、瘤坏死因子受体相关因子-6(TRAF-6)、MyD88衔接蛋白Mal/TIRAP (MyD88-adapter-like)/(TLR domain-containing adapter protein)、含 TIR 结构域的蛋白诱导干扰素(TIR domain-containing adaptor protein inducing IFN，TRIF)，也叫TIR-containing adapter molecule 1,TICAM1和TRIF相关接头分子(TRIF-related adaptor molecule,TRAM)等[10]。

TLRs与衔接蛋白结合后，胞外信号随即进入胞内，主要通过两条途径启动下游一系列级联反应：MyD88依赖途径和MyD88非依赖途径。除TLR3外所有的TLRs介导的信号通路均可通过MyD88 依赖途径发挥作用，包括TLR-2在内；而TLR4介导的信号通路则同时存在于这两条单独的信号途径，在NF-κB介导的基因感应中被TIRAP启动联合MyD88、在第一型干扰素的产生中被TRAM启动联合TRIF[11]。而根据信号传导过程中有无MyD88衔接蛋白的参与而分为MyD88依赖和MyD88非依赖两种传导途径。这两种信号传导途径，最终均需激活NF-κB，引起下游细胞因子分泌，即无论哪种信号传导途径,NF-kB都处于下游信号传导过程的中枢地位。

3 Toll样受体介导的信号通路在OA进程中发挥重要作用

3.1 Toll样受体介导的滑膜细胞固有免疫应答是促进OA滑膜炎的关键环节 目前，TLRs在如系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)、类风湿性关节炎(rheumatoid Arthrits，RA)和组织损伤等炎症性疾病中的作用已有明确表述，但还没有关于其在OA病程进展中作用的系统而直接的论述。OA是以关节软骨和软骨下骨损伤、骨赘形成及滑膜炎症反应为基本病理变化的慢性退行性骨关节病。属自身免疫性疾病的一种，异常释放和浸润的炎症介质、细胞因子引起滑膜炎症和骨质的改变，最终导致组织破坏、关节畸形和功能障碍。OA的病程涉及多种免疫细胞及信号通路等的参与，其中，固有免疫系统作为机体防御各种病原体入侵的决定性屏障，通过PRRs识别PAMPs或DAMPs并与之结合后被激活[9]，固有免疫应答反应在诱发和进行性加重OA进程中起着重要的作用。最新研究发现，TLRs作为固有免疫应答系统组成中一类重要的PRRs大家族，其活化后可通过一系列反应广泛参与识别PAMPs和感知DAMPs，诱导多种炎性介质和因子的合成与释放，诱发或加重OA[12]，可见，由其介导的固有免疫应答反应是促进OA病程进展的关键环节[13]。

3.2 TLRs在OA中的表达 TLRs作为一种PRRs广泛分布于参与OA病程的各种免疫细胞中，随着研究的逐渐深入，在越来越多类的非免疫细胞中同样发现了TLRs的表达。种种证据表明，TLRs的表达与OA的病程进展密切相关，其中，TLR2和TLR4作为TLRs家族的主要成员更是影响OA发生发展的关键分子。OA患者在早期阶段就有TLR2和TLR4在滑膜组织中表达，尽管其程度较RA相对较轻，但相较正常的滑膜组织而言，其蛋白表达量明显偏高，同时伴随着诸如关节疼痛、肿胀、关节腔积液等临床表现[14]。研究表明，TLRs在OA关节软骨和滑膜细胞中均有表达。KIM HA等[15]研究证实在骨关节炎软骨组织中检测到TLR2、TLR4的表达；RADSTAKE等[16]研究发现,TLR2和TLR4在OA 滑膜组织中存在并大量表达，但正常的滑膜组织中几乎检测不到其表达;NAIR A等[17]则在早期OA患者的关节滑液中发现与TLR2、TLR4配体应答相关的显著增加的滑膜成纤维细胞。上述研究提示TLRs在关节软骨和滑膜中的表达对OA的进程有着某种重要的意义。

3.3 TLRs的表达与OA病程进展的关系 固有免疫系统不仅起到为宿主防御微生物入侵的作用，还能多种形式的调节组织损伤和修复,包括分别识别特有的PAMPs和DAMPs，均通过激活的PRRs触发细胞信号转导，引起促炎性细胞因子和趋化因子的产生，诱发炎症反应。这些原始的固有免疫炎症反应被建立用来介导很多急性和慢性型式的组织损伤[18]。这些OA关节的组织退行性变就类似于一种慢性的损伤[19]。一方面,TLRs作为最大的PRRs家族成员之一，触发信号转导通路通过包括NF-κB在内的转录因子导致炎性基因的表达。另一方面，在OA关节损伤时有些PAMPs或DAMPs(如高迁移率族蛋白-1(high mobility group box protein 1,HMGB1)、S100钙粒蛋白家族等)的浓度在关节滑液或组织中增加[20]。这些PRRs和PAMPs、DAMPs在推进滑膜炎症和软骨降解的各种能力在不同的动物模型研究中被广泛的提供信息。每一种在特定的OA表型和不同的OA阶段中都发挥着不同的作用。

截至目前为止，TLR2、TLR4在RA患者的表达中已有个别报道。钱雷等[21]发现早期RA患者的外周血单核细胞 (peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中TLR2表达增加，而TLR4则下降，推测疾病初期TLR4可能通过促进血管炎症因子的黏附，后期TLR2通过提高金属蛋白酶的含量和促进破骨细胞的形成主导者关节破坏作用。熊小泉等[22]通过对不同时期的大鼠PBMC检测后发现造模15d后，TLR4表达显著增加，25d后则略有下降，推测15d为RA的活动期，固有免疫系统启动，而25d后进入稳定期，炎症因子消退，TLR4mRNA含量明显降低。然而，对于TLRs在OA进程的报道则少之又少。ZHANG等[23]研究表明TLR2的表达在OA晚期的表达受到明显抑制。TIMOTHY R等[16]研究发现，滑膜炎症中期的TLR2表达明显高于TLR4。QIAN Chen等[24]研究显示，TLR4的表达与软骨细胞的凋亡程度呈正相关，并证实TLR4在OA进程中发挥着重要的作用。笔者在前期研究中，通过经典Hulth法建立了大鼠轻、中、重度OA动物模型，在形态学观察的基础上研究OA进程的不同时期各组滑膜组织TLR2和TLR4的表达变化，从信号转导通路出发研究OA滑膜炎症的发生发展机制，探讨 TLRs 与 OA病程进展的相关性。研究结果显示，TLR2的表达量随造模时间的延长而逐渐增加，TLR4则有明显的抑制趋势，NF-κB表达持续增加。这与上述文献中所阐述的研究结果基本吻合。推测其可能的机制为：随OA的病程进展，坏死细胞数量增多，更多TLR2配体被释放。而早期的OA中，TLR4活化引发一系列的炎症反应，固有免疫系统启动，机体的保护性反应被触发，进而反馈性的对TLR4的活化起到了抑制作用，使其表达逐渐下降。以上研究进一步表明了TLRs介导的炎症通路与OA的病例进程的相关性。

TLRs及其介导的信号通路参与了OA发生发展全过程，在组织修复和关节结构破坏上起到不可忽视作用。因而，随着对OA发病和进展机制及TLRs作用了解的逐渐深入，试图以TLRs及其相关配体、介导的信号通路上MyD88、NF-κB等元件和下游炎性介质等为靶点，通过对其的干预最终达到对OA的缓解甚至治愈的目的，成为OA预防及治疗的新趋势。

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Toll-like receptors in osteoarthritis

WANG Huan1,WANG Qingfu2*,YIN Yueshan2,ZHANG Dong1,WANG Weili1,DING Haobin1,GUO Yuru1,DU Wangyang1,GAN Wen1,XU Mingkang1

(1.Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;2.The Third Affiliated Hospital of Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

Toll-like receptors (TLRs) are important members of pattern recognition receptors (PRRs) in body's natural immune system,which can trigger myeloid differentiation factor 88 (MyD88)dependent pathway or MyD88 independent pathway that actives NF-κB and lead to the secretion of cytokines and inflammatory mediators by identified pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and endogenous damage associated molecular patterns (DAMPs) recognition.Then start the natural immune response,play an important role in the process of osteoarthritis (OA).Explore TLR family molecules and NF-κB pathway in OA can provide a theoretical basis for the further study of the mechanism and prevention and treatment in OA.

Toll-like receptor;knee osteoarthritis;NF-κB signal passway

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.06.058

国家自然科学基金面上项目(81373662)；北京中医药大学自主选题项目(2014-JYBZZ-XS-171)。

王 欢(1986-)，女，博士研究生。

R274.9

A

2095-6258(2016)06-1265-04

辑：张 忠

2016-01-16)

*通信作者：王庆甫，男，教授，电话-(010)52075209，电子信箱-qingpu-wang@sohu.com