杨　勇，王中江，毕　爽，张　辉，李　杨，江连洲*（.东北农业大学食品学院，哈尔滨　5000；2.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，农产品加工黑龙江省普通高校重点实验室，黑龙江　齐齐哈尔　6006；.科技部中国农业技术开发中心，北京　00045）



深黄被孢霉突变菌株发酵制备花生四烯酸工艺研究

杨勇1, 2，王中江1，毕爽1，张辉3，李杨1，江连洲1*
（1.东北农业大学食品学院，哈尔滨150030；2.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，农产品加工黑龙江省普通高校重点实验室，黑龙江齐齐哈尔161006；3.科技部中国农业技术开发中心，北京100045）

摘要：在单因素试验基础上，采用响应面分析法优化深黄被孢霉突变菌株发酵制备花生四烯酸工艺，确定最优发酵工艺条件为：接种量15.66%，发酵温度28.29℃，发酵时间6.58 d，发酵pH 5.96。花生四烯酸产量为3.12 g·L-1，在最优发酵工艺条件下，可提高产量，同时减少接种量，缩短发酵时间，降低生产成本。

关键词：深黄被孢霉；突变菌株；发酵；花生四烯酸

杨勇,王中江,毕爽,等.深黄被孢霉突变菌株发酵制备花生四烯酸工艺研究[J].东北农业大学学报, 2016, 47(1): 45-50.

Yang Yong, Wang Zhongjiang, Bi Shuang, et al. Research on preparation technology for arachidonic acid by fermentation of Mortierella isabellina mutant strain[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2016, 47(1): 45-50. (in Chinese with English abstract)

花生四烯酸（ARA）含有4个双键，其中第1个双键是在甲基端起第6个和第7个碳原子间发生去饱和反应形成，属于ω-6系列多不饱和脂肪酸[1]，对人体生长发育具有重要作用。ARA具有抗氧化、抗炎症、抗癌、降血脂、抑制血小板聚集等多种生物活性[2-3]，已在食品、医药、化妆品等领域得到广泛应用[4]。目前，制备ARA方法很多，最有效方法是微生物发酵制备法，而被孢霉、高山被孢霉主要用于工业化生产菌株。被孢霉属真菌在制备ARA上具有较大优势，因其具有良好生长活力、易于扩培及强生产能力逐渐成为发酵制备ARA主要真菌菌株[5]。微生物发酵法生产花生四烯酸最早始于1979年，Penicillium cyaneu菌体内富含花生四烯酸[6]。周蓬蓬等通过诱变原始产花生四烯酸菌株获得高山被孢霉T105和高山被孢霉M20等高产菌株[7]。于长青等利用深黄被孢霉高产花生四烯酸菌株紫外诱变原生质体育种获得生长活力较强，产花生四烯酸能力强菌株[8]。

深黄被孢霉是丝状真菌，在含有碳水化合物碳源培养基中发酵时，菌体内发酵合成油脂，含有丰富多不饱和脂肪酸，其中ARA含量较高[9]。大多数被孢霉为野生菌株，ARA产量低，提高ARA产量必须对已有菌株诱变育种，选择具有高产ARA特性突变菌株。深黄被孢霉突变菌株用于制备花生四烯酸发酵工艺研究鲜见报道。本试验对深黄被孢霉突变菌株发酵制备花生四烯酸工艺进行研究，在单因素试验基础上，采用响应面分析法优化发酵工艺，为花生四烯酸生产及加工提供依据。

1　材料与方法

1.1试验原料

深黄被孢霉As3.3410：由东北农业大学食品学院提供；马铃薯：市售；七水硫酸镁、磷酸二氢钾、葡萄糖、琼脂、酵母膏、柠檬酸钠等化学试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备

高压灭菌锅（购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；HGCE-F160型恒温振荡培养箱（购自北京市永光明医疗仪器厂）；GC9900型气相色谱仪（购自上海科创色谱仪器有限公司）。

1.3方法

1.3.1培养基制备

PDA斜面培养基：将马铃薯去皮后切碎，加一定量蒸馏水使马铃薯浓度为20%，蒸煮30 min后过滤。向马铃薯浸提液中加入七水硫酸镁0.15%、磷酸二氢钾0.3%、葡萄糖2%、琼脂1.5%，调pH为6.0，121℃高压灭菌15 min。

发酵培养基：葡萄糖10%、酵母膏0.3%、磷酸二氢钾0.2%、柠檬酸钠0.2%、硫酸镁0.05%，调pH为6.0，121℃高压灭菌15 min。

1.3.2突变菌株制备

将深黄被孢霉As3.3410接种于PDA斜面培养基28℃培养7 d，待孢子大量生成用无菌水清洗，并溶于生理盐水中，使活菌数达到105cfu·mL-1制得菌悬液，在紫外光功率20 W下紫外诱变45 s得到一次突变菌株As3.3410-UV4，在微波功率400 W下微波诱变40 s，经紫外和微波两次诱变后，得到稳定高产ARA二次突变菌株As3.3410-UV4-MW56。

1.3.3生产ARA发酵工艺单因素试验

将突变菌株接种于PDA斜面培养基28℃培养7 d，待孢子大量生成用无菌水清洗，并溶于生理盐水中，使活菌数达到105cfu·mL-1制得菌悬液。将菌悬液接入发酵培养基中，混匀后180 r·min-1振荡培养，发酵生产ARA。基本发酵工艺参数为：接种量18%，发酵温度28℃，发酵时间6 d，发酵pH 6。在其他条件不变情况下，以生物量、油脂产量和ARA产量为指标，选取接种量为14%、16%、18%、20%、22%，发酵温度为24、26、28、30和32℃，发酵时间为4、5、6、7和8 d，发酵pH为5、6、7、8、9，进行单因素试验，每个水平重复3次取平均值。

1.3.4生产ARA发酵工艺响应面优化试验

在单因素试验基础上，根据中心组合设计原理，设计响应面分析试验，利用Design-Expert软件对试验过程优化，以ARA产量R（g·L-1）为响应值，选择接种量A（%）、发酵温度B（℃）、发酵时间C（d）和发酵pH D为影响因素，每个因素设定5个水平试验。其因素水平编码见表1。

表1因素水平编码Table 1 Factor levels coding table

1.3.5生物量测定

采用细胞干质量法[10]测定生物量。将发酵液离心后弃上清液，得到菌体沉淀物水洗2次后，放入铝盒于70℃烘箱中烘干至恒重得到干菌体，称干重，生物量计算公式如下：

生物量（g·L-1）=菌体干重（g）/发酵液体积（L）

1.3.6油脂产量测定

采用索氏抽提法对发酵液进行微生物油脂提取[11]。将干菌体用研钵磨成粉，取2 g于索氏抽提器中用乙醚80℃提取6 h，回收乙醚，100℃下1 h烘干，称干重。

油脂产量（g·L-1）=油脂干重（g）/发酵液体积（L）

1.3.7 ARA产量测定

采用气相色谱测定ARA含量[12]。样品处理：取微生物油脂25 mg于容量瓶中，加入体积分数1%硫酸-甲醇混合液5 mL，于70℃水浴中加热2 h，然后加入5 mL正己烷清洗1次，合并上清液，放入10 mL离心管中，加入少量无水Na2SO4去除水分，静置4 h后进样。

气相色谱条件：色谱柱为弹性石英毛细管柱FFAP（30 m×0.32 mm×0.5 μm）；柱初温为100℃，以8℃·min-1升温至240℃，然后恒温至完成分析；汽化室温度为250℃；载气体积流量为48 mL·min-1；氢气体积流量为42 mL·min-1；空气体积流量为261 mL·min-1；尾吹体积流量为34 mL·min-1；进样量为4 μL。ARA产量为1 L发酵液中干菌体所含ARA质量（g）。

1.3.8统计分析

采用SPSS V 17.0软件进行ANOVA差异显著性分析，采用Origin 8.0软件作图，采用Design-Expert软件中心组合设计进行数据分析。

2结果与分析

2.1发酵菌株选择

由图1可知，深黄被孢霉As3.3410、一次突变菌株As3.3410-UV4和二次突变菌株As3.3410-UV4-MW56对发酵制备油脂具有不同影响。不同菌株发酵制备油脂优劣性比较为：As3.3410-UV4-MW56>As3.3410-UV4>As3.3410。不论从生物量角度、油脂产量角度还是ARA产量角度分析，最优菌株均为二次突变菌株As3.3410-UV4-MW56，为高产ARA菌株，且具有较高稳定性。因此，选择二次突变菌株As3.3410-UV4-MW56为发酵制备ARA最佳菌株。

图1深黄被孢霉突变菌株对发酵制备ARA影响Fig. 1 Effect of Mortierella isabellina mutant strain on fermentation production of ARA

2.2发酵工艺单因素试验

2.2.1接种量对诱变菌株发酵制备ARA影响

由图2可知，随接种量增加，生物量、油脂产量和ARA产量呈先增后降趋势，接种量为18%时，生物量和油脂产量最大；接种量为16%时，ARA产量最大。接种量增加会使参与发酵活菌数增加，在一定范围内可提高生物量、油脂产量和ARA产量；当接种量过大时，由于营养物质含量一定，不能满足菌体生长需要，且抑制菌体繁殖，导致生物量、油脂产量和ARA产量均下降，影响ARA制备。因此选取接种量为16%。

图2接种量对突变菌株发酵制备ARA影响Fig.2 Effect of inoculum concentration on fermentation production of ARA by mutant strain

2.2.2发酵温度对诱变菌株发酵制备ARA影响

由图3可知，随发酵温度增加，生物量、油脂产量和ARA产量逐渐增加，发酵温度为28℃时，生物量、油脂产量和ARA产量均最大，再继续增加发酵温度，生物量、油脂产量和ARA产量反而降低。微生物生长繁殖存在最适温度范围，超过范围会抑制生长，也会影响发酵性能，控制发酵温度对生物法制备ARA极为重要，适当降低发酵温度利于产物合成。综合考虑，选取发酵温度为28℃。

图3发酵温度对突变菌株发酵制备ARA影响Fig. 3 Effect of fermentation temperature on fermentation production of ARA by mutant strain

2.2.3发酵时间对诱变菌株发酵制备ARA影响

由图4可知，随发酵时间延长，生物量、油脂产量和ARA产量增加，当发酵时间延长到6 d时，生物量、油脂产量和ARA产量趋于平缓，且不再随发酵时间延长而增加。发酵初期，菌体细胞能利用发酵培养基中营养物质快速生长繁殖，使生物量、油脂产量和ARA产量增加，但当发酵时间过长时，菌体细胞发生自溶或菌丝体不再生长，对发酵制备ARA造成不利影响。综合考虑，选取发酵时间为6 d。

2.2.4发酵pH对诱变菌株发酵制备ARA影响

由图5可知，随发酵pH增加，生物量、油脂产量和ARA产量呈先增后降趋势，随后逐渐趋于平缓，发酵pH为6时，生物量、油脂产量和ARA产量均达到最大。微生物生长繁殖具有最适pH范围，超过范围会抑制生长，也影响发酵性能；菌体在发酵过程中会产生大量有机酸，使pH下降，超过最适范围，影响菌体发酵制备ARA，通过人为控制pH保证菌体正常发酵。综合考虑，选取发酵pH为6。 2.3发酵工艺优化

图4发酵时间对突变菌株发酵制备ARA影响Fig. 4 Effect of fermentation time on fermentation production of ARA by mutant strain

图5发酵pH对突变菌株发酵制备ARA影响Fig. 5 Effect of fermentation pH on fermentation production of ARA by mutant strain

试验采用响应曲面法过程优化，采用统计软件Design-Expert试验设计与数据处理。以接种量A （%）、发酵温度B（℃）、发酵时间C（d）和发酵pH D分别代表自变量，以ARA产量R（g·L-1）为响应值，响应面试验方案及结果见表2。试验号1~24为析因试验，25~36为12个中心试验，用以估计试验误差。

表2试验设计及结果Table 2 Experimental design and result

利用Design-Expert软件对表2试验数据进行多元回归拟合，获得ARA产量R对自变量接种量A、发酵温度B、发酵时间C和发酵pH D二次多项回归模型方程为：

R=2.98-0.13A + 0.031B + 0.074C + 0.066D + 0.076AB-0.0037AC + 0.19AD + 0.29BC-0.27BD + 0.026CD-0.20A2-0.34B2-0.13C2-0.33D2

对该模型进行方差分析，结果见表3。

表3回归方程方差分析结果Table 3 Variance analysis results of regression equation

由表3可知，方程因变量与自变量之间线性关系明显，该模型回归显著（P<0.0001），失拟项不显著（P>0.05），且该模型R2=95.39%，R2Adj=92.32%，模型与试验拟合良好，自变量与响应值之间线性关系显著，可用于该反应理论推测。由F检验可得到因子贡献率为：A>C>D>B，即接种量>发酵时间>发酵pH>发酵温度。交互项BC、BD交互作用显著，两因素交互作用（显著项）对ARA产量影响响应面分析见图6。

由图6可知，不同因素交互作用对ARA产量产生影响。两因素交互作用可反映响应值变化规律，同时影响响应值变化程度。ARA产量随发酵温度、发酵pH增加，呈先增后减趋势；随发酵时间延长增加到一定值后趋于平衡，与单因素试验结果一致。

图6两因素交互作用(显著项)对ARA产量影响响应面Fig.6 Effect of interaction between two factors (significantly) on ARA yield

通过分析软件Design-Expert寻找最优响应结果为：A、B、C和D对应编码值分别为-0.34、0.29、0.58和-0.09，ARA产量有最大值3.03 g·L-1。理论最优发酵工艺条件为：接种量15.66%，发酵温度28.29℃，发酵时间6.58 d，发酵pH 5.96。为验证模型预测准确性，在响应面优化发酵工艺条件下，重复3次验证试验取平均值，优化ARA产量平均值为3.12 g·L-1，与理论值3.03 g·L-1较接近，说明响应值试验值与回归方程理论值吻合良好。最终确定深黄被孢霉突变菌株发酵制备花生四烯酸最优工艺条件为：接种量15.66%，发酵温度28.29℃，发酵时间6.58 d，发酵pH 5.96。

3结论

采用紫外和微波两次诱变得到突变菌株As3.3410-UV4-MW56为最佳菌株，接种量、发酵温度、发酵时间、发酵pH影响突变菌株发酵制备油脂。在单因素试验基础上，通过响应面分析法确定深黄被孢霉突变菌株发酵制备花生四烯酸最优工艺条件为：接种量15.66%，发酵温度28.29℃，发酵时间6.58 d，发酵pH 5.96。在最优发酵工艺条件下，ARA产量为3.12 g·L-1。

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Research on preparation technology for arachidonic acid by fermentation of Mortierella isabellina mutant strain

YANG Yong1,2, WANG Zhongjiang1, BI Shuang1, ZHANG Hui3, LI Yang1, JIANG Lianzhou1(1. School of Food, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2. Key Laboratory of Processing Agricultural Products of Heilongjiang Province, School of Food and Bioengineering, Qiqihar University, Qiqihar Heilongjiang 161006, China; 3. Ministry of Science and Technology of the People's Republic of China, China Rural Technology Development Center, Beijing 100045, China)

Abstract:On the basis of single factor experiment, technological parameters of preparation for arachidonic acid by Mortierella isabellina mutant strain were determined by response surface methodology to optimize fermentation conditions as following: inoculum size was 15.66%, fermentation temperature was 28.29℃, fermentation time was 6.58 d, fermentation pH was 5.96. In the best fermentation process conditions, ARA yield was 3.12 g·L-1, which enhanced yield. At the same time, inoculum size was decreased, fermentation time was shortened, and production cost was reduced.

Key words:Mortierellaisabellina; mutant strain; fermentation; arachidonic acid

*通讯作者：江连洲，教授，博士生导师，研究方向为粮油加工。E-mail: jlzname@163.com

作者简介：杨勇（1979-），男，副教授，博士研究生，研究方向为粮油加工与食品安全。E-mail: yangyong7904@163.com

基金项目：黑龙江省自然科学基金项目（C201331）

收稿日期：2015-11-10

中图分类号：TS201.1

文献标志码：A

文章编号：1005-9369（2016）01-0045-06