刘春杰，董立珉，郑亚萍，康红钰（漯河医学高等专科学校，河南漯河462000）



丝瓜提取物对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤的保护性研究

刘春杰，董立珉，郑亚萍，康红钰
（漯河医学高等专科学校，河南漯河462000）

摘要：观察丝瓜提取物（Luffaextract，LE）对β-淀粉样蛋白（Aβ25－35）诱导的PC12细胞损伤的保护作用。应用Aβ25－35造成神经细胞损伤模型，用四甲基偶氮唑盐微量酶反应（MTT）比色法检测各剂量组丝瓜提取物对PC12细胞活力的变化，检测过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化氢酶（GSH-Px）活性水平，通过蛋白印迹试验（Western Blotting）来检测B细胞淋巴瘤基因-2（Bcl-2）和Bcl-2相关X蛋白（Bax）的表达水平。丝瓜提取物剂量组PC12细胞存活率高于模型组，GSHPx活性显著增强，CAT含量显著增加（P<0.01或P<0.05），Bax表达水平降低，Bcl-2表达增高，与模型组比较，差异显著（P<0.05～P<0.01）。丝瓜提取物对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤有明显的保护作用。

关键词：丝瓜提取物；PC12细胞；MTT检测；CAT；GSH-Px；Bcl-2；Bax

老年性痴呆（Alzheimer’s disease，AD）的病理性特征是老年斑（senile plaque，SP），而SP的核心成分是β-淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ），正常生理情况，Aβ具有营养因子的作用，但高浓度的长链Aβ往往具有神经毒性[1]，Aβ的产生、积聚增加是引起神经元退化和死亡的主要机制。Aβ可通过多种途径产生过氧化物和自由基，从而加剧过氧化损伤对神经细胞的伤害[2]。

丝瓜为葫芦科植物，近年来证明丝瓜有增强免疫、抗应激、抗病毒、促进生长等生理功能，能促进记忆的获得、巩固和再现，有促智作用。丝瓜提取物有明显抗氧化作用，用于美容可延缓衰老，广泛用于洗涤日用品[3]。本研究将探讨丝瓜提取物对β-淀粉样蛋白（Aβ25-35）损伤PC12细胞的神经保护作用，初步探讨丝瓜提取物对AD的神经保护机制。

1材料和方法

1.1药物和试剂

丝瓜提取物：西安森冉生物有限公司；PC12细胞：北京北纳创联生物技术研究院；MTT、Aβ25-35：Sigma公司；CAT、GSH-Px检测试剂盒：南京建成生物工程研究所；DMEM培养基、胎牛血清、马血清：杭州四季青工程材料研究所；Bcl-2、Bax抗体：SantaCruz生物技术公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2仪器

UV-9200紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；高速冷冻离心机：上海创赛科学仪器有限公司；电热恒温水槽：宁波天恒仪器厂；二氧化碳培养箱：Thermo公司；超净工作台：TBD生物仪器厂；EPOCH酶标仪：美国BioTek公司；凝胶扫描成像分析系统：美国startganee。

1.3 PC12细胞培养及建立损伤模型

用含15%的胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的DMEM高糖培养基，在37℃、5 %CO2饱和湿度条件下的CO2培养箱中培养，2 d～3 d换液1次，贴壁生长的细胞，加入0.25 %胰蛋白酶消化，细胞调整为1×105个/mL，接种于96孔细胞培养板，培养细胞进入对数生长期细胞，进行各项指标检测。离体培养的PC12细胞分为6组：空白组、模型组、丝瓜提取物高剂量组、丝瓜提取物中剂量组、丝瓜提取物低剂量组。模型组加入经老化处理的Aβ25-35（终浓度为20 μmol/L）培育36 h，建立AD细胞模型，丝瓜提取物各剂量组分别用终浓度（30.75、18.75、9.375 μg/mL）过夜培养共2 h后，再加入终浓度为20 μmol/LAβ25-35共同培养36 h，每组8孔，每孔200 μL。

1.4 MTT比色法检测细胞活力

将处于对数生长期的PC12细胞制成2×105个/mL悬液，置于96孔培养板内进行铺板，每孔200 μL，分别给与不同处理因素作用24 h，MTT检测时弃掉上清，再加入培养基180 μL，每孔再加MTT 20 μL，37℃培养4 h，然后吸出培养液，加入二甲基亚砜（DMSO）150 μL，振荡10 min后在酶标仪于560 nm波长处读取标本的吸光度，各组的吸光度与对照组的吸光度比值作为细胞的活力。按细胞相对活力计算公式：相对活力/%=[（处理组平均吸光度值－空白对照平均吸光度值）/（正常组平均吸光度值－空白对照组平均吸光度值）]×100。

1.5丝瓜提取物对氧化应激的PC12细胞中抗氧化能力的影响

取对数生长期细胞，用胰酶将细胞制成2×105个/mL悬液并接种于6孔培养板。丝瓜提取物用终浓度（30.75、18.75、9.375 μg/mL）预处理30 min，再加入终浓度为20μmol/LAβ25-35共同培养24h，完成给药及Aβ25-35处理后，超声破碎收集的细胞，4℃下3 000 r/min离心10 min，收集上清液，按照试剂盒方法测定细胞匀浆中CAT、GSH－Px活力。

1.6 Western blotting分析

加药处理细胞24 h后，收集细胞并洗涤，SDSPAGE电泳分离总蛋白，蛋白质转移到PVDF膜，5 %的脱脂奶粉室温封闭2 h。封闭过的膜用TBST洗涤3次，将膜放入杂交袋内，大鼠Bcl-2、Bax及β-actin-抗4℃孵育过夜，TBST洗涤3次，辣根过氧化物酶标记兔抗大鼠IgG 37℃孵育1 h，TBS漂洗，ECL法显色。凝胶成像系统分析扫描各条带灰度值，计算目的条带与内参照的灰度比值。

1.7统计分析

试验数据均以X±S表示，采用SPSS13.0软件进行统计分析，t检验法比较各组间差异，P＜0.05则认为组间差异显著。

2　结果

2.1丝瓜提取物对Aβ25-35诱导PC12细胞毒性的保护效果

与空白组相比，20 μmol/L的Aβ25-35处理后的细胞存活率明显下降，仅为55.23 %，具有显著差异性（P＜0.01）；当PC12预先经丝瓜提取物处理后再加Aβ25-35，细胞存活率显著增加，并呈现剂量依耐性的趋势，在丝瓜提取物（30.75、18.75、9.375 μg/mL）处理后细胞存活率分别能达到74.72 %、68.15 %及58.01 %。其中，9.375 μg/mL组与模型组相比，无统计学意义，而丝瓜提取物30.75、18.75 μg/mL可以有效抑制Aβ25-35所致的细胞损伤，提高细胞生存率，与模型组比较，有显著统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）结果见表1。

表1 MTT检测不同浓度的丝瓜提取物对Aβ25-35诱导PC12细胞毒性的保护作用Table 1 MTT test different concentrations of luffa extract protective effects on cytotoxicity of PC12 cells induced by Aβ25-35

2.2丝瓜提取物对Aβ25-35诱导PC12细胞抗氧化酶活性的影响

与空白组比较，20 μmol/L的Aβ25-35处理PC12细胞后，细胞内CAT、GSH-PX活性显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，丝瓜提取物各剂量组可显著增加CAT、GSH-PX活性（P＜0.01，0.05）。且具有一定的剂量相关性，见表2。

表2丝瓜提取物对Aβ25-35诱导PC12细胞中CAT、GSH-PX的影响Table 2 Effect of luffa extract on CAT，GSH-PX of PC12 cells induced by Aβ25-35

2.3丝瓜提取物对Aβ25－35诱导PC12细胞Bcl-2和Bax表达变化的影响

与空白组比较，20 μmol/L的Aβ25-35处理PC12细胞模型组，Bax表达明显升高（P＜0.01），Bcl-2表达明显降低（P＜0.01），Bcl-2/Bax表达比下降；与模型组比较，丝瓜提取物高、中、低剂量组Bax表达明显降低（P＜0.01），Bcl-2表达明显升高（P＜0.01），Bcl-2/Bax表达水平的比值与模型组比较明显上升。见表3和图1。

表3丝瓜提取物对Aβ25－35诱导PC12细胞Bcl-2和Bax表达变化的影响Table 3 Effect of luffa extract on expression changes of Bcl-2 and Bax in PC12 cells induced by Aβ25－35

1.空白组；2.模型组；3.LE低剂量组；4.LE中剂量组；5.LE高剂量组。图1丝瓜提取物对Aβ25－35引起的相关蛋白表达的影响Fig.1 Effect of luffa extract on protein expression induced by Aβ25-35

3　结论

近年来研究表明，人体随年龄增长所发生的退行性变化是细胞正常代谢过程中所产生的过量自由基副作用的结果。如果机体CAT、GSH-PX等抗氧化酶等减少，将导致体内自由基生成增加，加强过氧化反应，使组织和细胞受到破坏，从而使组织功能下降，引起生物体衰老。本研究表明Aβ25-35引起PC12细胞内CAT、GSH-PX等酶水平的降低，而PC12细胞经丝瓜提取物预处理后，能明显提高Aβ25－35抑制诱导的细胞内CAT、GSH-PX酶的水平，从而降低细胞内的氧化应激水平。减轻或阻断脂质过氧化物作用，保护机体免受过氧化氢物的损害，延缓细胞的衰老损伤，从而预防自由基导致的疾病的发生[4-5]。

Bcl家族中抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax的平衡对细胞是否进入凋亡通路起着重要的作用，即Bc1-2/Bax的比值决定了细胞是否发生凋亡[6-7]。试验结果显示，模型组Bc1-2蛋白表达反应性降低，Bax表达增强，Bc1-2/Bax的比值下降，促进细胞凋亡的发生。经丝瓜提取物干预后，Bcl-2表达增强，Bax表达减弱，Bcl-2/Bax的比值增高，抑制细胞凋亡，表明丝瓜提取物可抑制细胞凋亡。丝瓜提取物对AD小鼠脑神细胞的保护作用，可能是通过上调Bcl-2蛋白、下调Bax蛋白的表达，抑制细胞凋亡而实现，从而达到改善老年性痴呆的作用。

综上，丝瓜提取物对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤有着明显的保护作用，可能是通过增强PC12细胞的抗氧化应激和抗凋亡作用，但其防治AD的机制还有待于进一步的研究。

参考文献：

[1]谈震,范守文.灵芝多糖对β淀粉样蛋白诱导大鼠海马神经元细胞损伤的保护作用[J].药物生物技术,2010,17(5):430-433

[2]王文君,李大金,李君,等.中药复方更年春含药血清及其主要单体对Aβ25-35淀粉样蛋白所致细胞损伤的保护作用[J].中西医结合学报,2010,8(1):67-73

[3]潘永勤,李菁,朱伟杰,等.丝瓜降血脂及抗氧化作用的实验研究[J].中国病理生理杂志,2008,24(5):873-877

[4]蒋伟,屈海琪,袁丹华,等.金莲花中荭草苷和牡荆苷对D-半乳糖致衰老小鼠脑损伤的保护作用[J].中草药,2012,43(7):1376-1380 [5]于凤玲,刘晔石,于洪泉.灵芝多糖对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤的保护性研究[J].中风与神经疾病杂志,2012,29(7):633-635

[6]宋楠,庞伟,杨红澎,等.桑椹提取物对Aβ25-35淀粉样蛋白致PC12细胞损伤保护作用的初步研究[J].卫生研究,2012,41(6):925-929

[7]刘玲,王淑英.芍药苷对Aβ25-35诱导PC12细胞氧化损伤的影响[J].中国中药杂志,2013,38(9):1318-1322

The Protective Effect of Luffa Extract on Injury of PC12 Cells Induced by Aβ25-35

LIU Chun-jie，DONG Li-min，ZHENG Ya-ping，KANG Hong-yu
（Luohe Medical College，Luohe 462000，Henan，China）

Abstract：To study the protective effect of luffa extract on injury of PC12 cells induced by amyloid β protein （Aβ25-35）. Neurons injury model was induced by Aβ25-35. MTT assay was used to detect the cellular viability after different concentrations of luffa extract. The activity of catalase（CAT）and glutathione peroxidase（GSH-Px）were detected. The expression of Bcl-2 and Bax were detected by Western Blotting. Compared with the control group，the cellular viability of luffa extract group was increased，the activity of GSH -Px and CAT were significantly increased（P<0.01，P<0.05），the expression of Bax was decreased and Bcl-2 was increased（P< 0.05-P<0.01）. luffa extract can protect PC12 cells from Aβ25-35induced cytotoxicity.

Key words：luffa extract；PC12 cells；MTT assay；CAT；GSH-Px；Bcl-2；Bax

收稿日期：2015-09-09

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.006

作者简介：刘春杰（1971—），女（汉），副教授，研究生，研究方向：老年病及内分泌药理。

基金项目：河南省骨干教师资助课题（2011GGJS-281）；漯河医学高等专科学校校级科研课题（2014-S-LMC04）