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利用果蝇模型探讨SCA3/M JD与PD发病机制的相关性

2016-03-17李清华韦荔莉胡艳梅林小慧陈梅玲

安徽医科大学学报 2016年3期
关键词:帕金森果蝇转基因

崔 莹,李清华,韦荔莉,胡艳梅,林小慧,陈梅玲

利用果蝇模型探讨SCA3/M JD与PD发病机制的相关性

崔 莹1,李清华2,韦荔莉2,胡艳梅1,林小慧2,陈梅玲2

目的探讨脊髓小脑性共济失调3型/马查多—约瑟夫疾病(SCA3/MJD)与帕金森疾病(PD)在发病机制中的相关性。方法利用经典的GAL4/UAS系统,使用MHC-GAL4启动子,使毒性蛋白质片段(SCA3tr-Q78)特异性地于果蝇飞行肌中表达,构建MHC-GAL4/UAS系统的SCA3/MJD果蝇疾病模型。同样使用MHC-GAL4启动子,构建可导致常染色体隐性遗传性PD的致病基因PINK1无效突变的果蝇,得到经典的PD果蝇模型——PINK1B9。结果两种疾病模型果蝇的翅膀异常率均增高,肌肉内线粒体均出现退化,ATP值均明显降低,线粒体氧化呼吸链Complex I的亚基ND42的mRNA及NDUFS3蛋白的表达量均下降。结论同样作为神经退行性变的SCA3/MJD及PD在果蝇疾病模型中体现出了类似的果蝇表型异常及线粒体功能障碍,类似的发病机制可能为“异病同治”找到理论基础。

脊髓小脑性共济失调3型/马查多一约瑟夫疾病;帕金森疾病;线粒体;果蝇

脊髓小脑性共济失调3型/马查多—约瑟夫疾病(spinocerebellar ataxia type 3/Machado Joseph disease,SCA3/MJD)为常染色体显性遗传迟发性神经退行性疾病,是由于SCA3基因编码区存在大于47个由CAG编码的多聚谷氨酰胺(polyglutamine,polyQ)而引起的[1]。研究[2]证明SCA患者可无明显的共济失调症状,而以帕金森综合征为主要临床表现,且给予多巴胺制剂后治疗效果良好。同样,有研究[3-4]表明维生素K2可以挽救帕金森疾病(Parkinson's disease,PD)模型的表型,且对SCA3转基因果蝇模型的神经毒性具有抑制作用。PINK1(PTEN-induced putative kinase 1,PINK1)是一种PD相关基因,其编码线粒体相关的丝/苏氨酸激酶已证实对线粒体自噬、形态及质量控制均有调节作用[5]。过表达PINK1可以挽救SCA3转基因果蝇模型的线粒体功能[6]。该研究探讨在肌球蛋白重链-半乳糖调节上游启动子元件/上游激活序列(myosin heavy chain-galactose-regulated upstream promoter element 4/upstream activation sequence,MHC-GAL4/ UAS)系统中SCA3转基因果蝇模型与PD转基因果蝇模型在表型上的对比,并检测两者线粒体功能缺陷及分子发病机制的相关性。

1 材料与方法

1.1 主要材料果蝇品系:W1118、UAS-SCA3tr-Q78、UAS-SCA3tr-Q27、MHC-GAL4购自美国Bloomington果蝇中心。UAS-PINK1B9由中南大学医学遗传学国家重点实验室惠赠。戊二醛(天津市科密欧化学试剂有限公司),HClO4(天津市科密欧化学试剂有限公司),KOH(天津市科密欧化学试剂有限公司)。显微镜H-7650、高效液相色谱仪(德国Agilent公司)。

1.2 方法

1.2.1果蝇杂交

1.2.1.1构建UAS-SCA3tr-Q27/+;MHC-GAL4/ +的果蝇 将UAS-SCA3tr-Q27的雄果蝇与MHCGAL4的处女蝇杂交,收取F1代雄果蝇,其基因型为UAS-SCA3tr-Q27/+;MHC-GAL4/+的目的果蝇,即为与SCA3/MJD转基因果蝇相对应的正常对照组果蝇。

1.2.1.2构建UAS-SCA3tr-Q78/+;MHC-GAL4/ +的果蝇 将UAS-SCA3tr-Q78的雄果蝇与MHCGAL4的处女蝇杂交,收取F1代雄果蝇,其基因型为UAS-SCA3tr-Q78/+;MHC-GAL4/+的目的果蝇,即为SCA3/MJD疾病组果蝇。

1.2.1.3构建W1118/+;MHC-GAL4/+的果蝇将W1118的雄果蝇与MHC-GAL4的处女蝇杂交,收取F1代雄果蝇,即基因型为W1118/+;MHCGAL4/+的目的果蝇,即为与PINK1B9PD转基因果蝇相对应的正常对照组果蝇。

1.2.1.4构建PINK1B9/y;MHC-GAL4/+的果蝇将PINK1B9/FM6的处女蝇与MHC-GAL4的雄性果蝇杂交,收取F1代雄果蝇,即基因型为PINK1B9/y;MHC-GAL4/+,即为PD疾病组果蝇。

1.2.2数据采集

1.2.2.1果蝇形态学检测 观察4组实验果蝇体态:UAS-SCA3tr-Q27/+;MHC-GAL4/+,UAS-SCA-tr-Q78/+;MHC-GAl4/+,W1118/+;MHC-GAL4/ +,UAS-PINK1B9/+;MHC-GAL4/+。

1.2.2.2果蝇线粒体观察 果蝇分组同1.2.2.1,每组随机挑选第5天雄性果蝇5只,固定于2.5%的戊二醛。于显微镜H-7650(15 000×)下直接观察果蝇胸部间接飞行肌肉的线粒体形态。

1.2.2.3果蝇ATP值检测 果蝇分组同1.2.2.1取第5天雄性果蝇,每组取10 mg果蝇胸部组织(约50只果蝇胸部组织);在液氮中研磨,得到果蝇胸部组织,并加入200μl HClO4继续研磨;研磨后3 500 r/min离心15 min,取上清液,缓慢加入0.2 mol/L KOH,将样品pH调至7.5,3 500 r/min离心15 min;准备新的EP管移入上清液进行样品制备。此后,将样品在高效液相色谱仪上进行ATP水平检测。该试验独立重复3次。

1.2.2.4果蝇mRNA水平检测 果蝇分组同1.2. 2.1,用实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,Real-Time PCR)检测MHCGAL4/UAS系统的正常对照果蝇组及SCA3/MJD与PD疾病果蝇组中ND42 mRNA表达水平。取第5天的雄性果蝇胸部10 mg(约50只果蝇胸部组织),提取总RNA。用primer 5.0软件设计引物,合成18s(内参)、ND42引物,由Invitrogen有限公司合成,进行全定量PCR,检测上述果蝇品系ND42的mRNA表达水平。具体引物序列如下:18s上游:5′-TCTAGCAATATGAGATTGAGCAATAAG-3′,下游:5′-AATACACGTTGATACTTTCATTGTAGC-3′;ND42上游:5′-CGTTTCGATGTCCCGGAGCT-3′,下游:5′-GTCTGCATTGTAGCCAGGAC-3′

1.2.2.5Western blot检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氧酶铁-硫蛋白3(NADH dehydrogenase[ubiquinone]iron-sulfur protein 3,NDUFS3)蛋白的表达果蝇分组同1.2.2.1,检测MHC-GAL4/UAS系统的正常对照果蝇组及SCA3/MJD与PD疾病果蝇组中NDUFS3蛋白表达水平。取第5天的雄性果蝇胸部10 mg(约50只果蝇胸部组织),用RIPA裂解液提取总蛋白。配制12%SDS丙烯酰胺凝胶,将蛋白与5×Loading Buffer混合后上样,使用50 mA恒流电泳。将蛋白转至PVDF膜上(恒压150 V,1 h)。用5%脱脂牛奶将膜封闭2 h后用TBST冲洗1次。一抗以工作液浓度1∶1 000,4℃孵育过夜,加入辣根过氧化酶标记的二抗(NDUFS3为鼠抗1∶1 000;βactin为鼠抗1∶1 000)孵育1 h,用ECL发光剂压胶片发光、显影。

1.3 统计学处理利用SPSS 17.0统计软件进行分析,实验数据采用-x±s表示,组间计量资料比较采用成组设计的t检验。

2 结果

2.1 SCA3/MJD转基因果蝇模型与PD转基因果蝇模型将人类SCA3/MJD致病的外源基因UASSCA3tr-Q78转入果蝇基因组内,构建出SCA3/MJD转基因果蝇模型。当这种模型在MHC-GAL4肌肉启动子的启动下,使毒性蛋白特异地在肌肉组织中表达时,果蝇表现出翅膀表型的异常及运动能力的缺陷。与表达正常长度CAG重复序列的UASSCA3tr-Q27的正常对照组果蝇相比,果蝇翅膀出现竖立、分叉、下垂等异常现象。这种果蝇肌肉功能受损的情况同样出现于PINK1基因敲除的PD果蝇转基因果蝇模型——PINK1B9果蝇模型中,见图1。

2.2 SCA3/MJD转基因果蝇模型与PD转基因果蝇模型的ATP水平比较SCA3/MJD转基因果蝇模型与PD转基因果蝇模型的ATP水平均比相对应的正常对照组明显降低,差异有统计学意义(t1= 6.252,P1<0.01;t2=5.436,P2<0.01)。见图2。

2.3 SCA3/MJD转基因果蝇与PD转基因果蝇模型的肌肉线粒体的观察透射电镜下观察显示,SCA3/MJD转基因果蝇线粒体与正常对照组相比,线粒体表现出过度膨胀的形态、线粒体形态不分明,融合在一起。同样地PD转基因果蝇与正常对照组果蝇相比也表现出线粒体膨胀的形态。见图3。

2.4 SCA3/MJD转基因果蝇与PD转基因果蝇模型的线粒体功能相关指标的检测与正常对照组相比,两种疾病组的ND42 mRNA水平及NDUFS3蛋白表达量均明显降低(t3=3.292,P3<0.05;t4= 3.644,P4<0.05)。见图4。

3 讨论

SCA3是SCA中最常见的亚型,在中国人群中,该型几乎占所有SCA3患者的50%[7-8]。SCA3/ MJD致病基因编码区内具有异常CAG三核苷酸重复序列,正常重复次数在13~36,而SCA3/MJD患者可高达62~82次。将重复78次的三核苷酸CAG的序列的cDNA经PUAST载体整合入果蝇胚胎中,构建出表达突变蛋白SCA3tr-Q78的果蝇[9]。选用在肌肉组织中特异性表达的MHC-GAL4启动子启动[10],使突变蛋白的毒性在果蝇的肌肉中表达,SCA3/MJD转基因果蝇表现出异常的翅膀叉开、竖起、下垂的异常形态。由于SCA3在临床上除了以小脑性共济失调、眼球运动障碍、视神经萎缩、锥体束征等的表现外,国内外均有报道提出,SCA3/MJD和PD在临床表现上具有相似性,发病部位也具有重叠性,在基因诊断出的SCA3/MJD的家系中出现了临床表现为帕金森病症状的患者[11]。且对于此类疾病确切的发病机制目前尚不清楚,也无任何特殊的治疗方法。已经有大量的研究[12-13]表明,由帕金森相关基因PINK1突变导致的PD果蝇模型明显地表现出了果蝇肌肉组织的退化、线粒体功能障碍的致病特点。研究[14]证明SCA患者可无明显的共济失调症状而以帕金森综合征为主要临床表现,且给予多巴胺制剂后治疗效果良好。另外有研究[15]表明,维生素K2已经被证实可以作为类似泛醌的电子传递链重要组分。可以挽救PD转基因果蝇PINK1B9的表型及线粒体功能。国内也有研究[16]证实了,维生素K2同样可以挽救SCA3/MJD转基因果蝇的神经毒性。且过表达帕金森相关基因PINK1可以挽救SCA3/MJD转基因果蝇的线粒体功能[17]。这些研究均表明SCA3与PD的发病机制有着相似性。但是具体的发病机制的相关性比较尚不明确。本研究显示SCA3/MJD转基因果蝇与PD转基因果蝇一样在MHC-GAL4启动子启动后具有相似的翅膀异常表现。肌肉中的线粒体也同样表现为过度膨胀的形态。体现线粒体功能的ATP水平也同样表现为疾病组明显比相应的正常对照组降低。且SCA3/MJD的线粒体功能障碍不仅仅体现在已有研究[18-19]所表明的mtDNA表达的降低及线粒体氧化呼吸链Complex II的功能受损,本研究也表明SCA3/MJD转基因果蝇中线粒体氧化呼吸链Complex I的亚基ND42的mRNA表达同PINK1基因突变所致的PD一样表达降低;Complex I的组分NDUFS3蛋白的表达量也同样明显降低。本研究显示,对这两种神经退行性变的转基因果蝇模型SCA3/MJD和PINK1B9的发病机制的相关性研究,得到了这两种疾病模型无论在表型上还是在线粒体功能异常上具有一致的表现,也就能够解释可以提高线粒体电子传递链水平的维生素K2能够同样抑制SCA3/MJD及PD转基因果蝇的神经毒性,及过表达PINK1不仅可以挽救PINK1B9转基因果蝇的表型,也同时可以挽救SCA3/MJD转基因果蝇线粒体功能的原因。为同样类型发病机制的神经退行性疾病能够达到“异病同治”找到理论基础。

[1] Jacobi H,Bauer P,Giunti P,etal.The natural history of spinocerebellar ataxia type 1,2,3,and 6:a 2-year follow-up study[J]. Neurology,2011,77(11):1035-41.

[2] 宋兴旺,郭纪锋,杨 茜,等.表现为帕金森综合征的SCA3/ MJD一家系临床及基因突变研究[J].中华内科杂志,2006,45(10):841-2.

[3] Vos M,Esposito G,Edirisinghe JN,et al.Vitamin K2isamitochondrial electron carrier that rescues pink1 deficiency[J].Science,2012,336(6086):1306-10.

[4] 韦荔莉,陈梅玲,林小慧,等.维生素K2对SCA3/MJD转基因果蝇的神经保护作用研究[J].华夏医学,2014,27(1):1 -4.

[5] Pridgeon JW,Olzmann JA,Chin L S,etal.PINK1 protectsagainst oxidative stress by phosphorylating mitochondrial chaperone TRAP1[J].PLoSBiol,2007,5(7):e172.

[6] 曾爱源,李 琼,黄 强,等.过表达PINK1改善SCA3/MJD转基因果蝇模型的线粒体功能[J].中国生物化学与分子生物学报,2015,31(1):88-95.

[7] Bossy-Wetzel E,Schwarzenbacher R,Lipton SA.Molecular pathways to neurodegeneration[J].Nat Med,2004,10 Suppl:S2-9.

[8] Jiang H,Tang B,Xia K,et al.Spinocerebellar ataxia type 6 in Mainland China:molecular and clinical features in four families[J].JNeurol Sci,2005,236(1-2):25-9.

[9] Warrick JM.Ataxin-3 suppresses polyglutamine neurodegeneration in Drosophila by a ubiquitin-associated mechanism[J].Mol Cell,2005,18(1):37-48.

[10]Takeyama K,Ito S,Yamamoto A,et al.Androgen-dependent neurodegeneration by polyglutamine-expanded human androgen receptor in Drosophila[J].Neuron,2002,35(5):855-64.

[11]Züchner S,Vance JM.Mechanisms of disease:a molecular genetic update on hereditary axonal neuropathies[J].Nat Clin Pract Neurol,2006,2(1):45-53.

[12]Geisler S,HolmströK M,Treis A,et al.The PINK1/Parkin-mediated mitophagy is compromised by PD-associated mutations[J]. Autophagy,2010,6(7):871-8.

[13]Park J.The PINK1-Parkin pathway is involved in the regulation of mitochondrial remodeling process[J].Biochem Biophys Res Commun,2009,378(3):518-23.

[14]Rahman M S.Genetic testing for spinocerebellar ataxias in patients diagnosed as Parkinson′s disease in Bangladesh[J].Mymensingh Med J,2015,24(1):44-51.

[15]Vos M.Vitamin K2is amitochondrial electron carrier that rescues pink1 deficiency[J].Science,2012,336(6086):1306-10.

[16]韦荔莉,陈梅玲,林小慧,等.维生素K2对SCA3/MJD转基因果蝇的神经保护作用研究[J].华夏医学,2014,27:1-4.

[17]Yang Y,Ouyang Y,Yang L,et al.Pink1 regulatesmitochondrial dynamics through interaction with the fission/fusion machinery[J].Proc Natl Acad Sci U SA,2008,105(19):7070-5.

[18]LaÇo M N,Oliveira CR,Paulson H L,et al.Compromised mitochondrial complex II in models of Machado-Joseph disease[J]. Biochim Biophys Acta,2012,1822(2):139-49.

[19]Yu Y C,Kuo C L,ChengW L,et al.Decreased antioxidant enzyme activity and increased mitochondrial DNA damage in cellular models of Machado-Joseph disease[J].JNeurosci Res,2009,87(8):1884-91.

Research on the correlated pathogenisis between SCA3/M JD transgenic Drosophila models and PD transgenic Drosophila models

Cui Ying1,Li Qinghua2,Wei Lili2,et al
(1Clinical College of Guilin Medical University,Guilin 541004;2Dept of Neurology,Affiliated Hospital of Guilin Medical University,Guilin 541001)

ObjectiveTo reveal the correlated pathogenisis between Spinocerebellar ataxia type 3(SCA3)/MachadoJoseph disease(MJD)and Parkinson′s Disease(PD).MethodsHere,using the classicalmodel of GAL/UAS system,and the MHC-GAL4 promotor tomake the pathogenic protein fragment(SCA3tr-Q78)expressed in Drosophila muscles,thus SCA3/MJD transgenic Drosophilamodelswere constructed.Using the same approach,we constructed the classical PD transgenic Drosophila models—PINK1B9which was dominantly modified PD related gene PINK1 nullmutant.ResultsThe two diseasemodels exhibited similar abnormalwing posture,the degraded mitochondria in muscle fibers and the decreased ATP levels.In the diseasemodels,the expression ofmitochondrial oxidative respiratory chain complex Isubunit ND42mRNA decreased and the expression of NDUFS3 protein reduced which also morked the function of complex I.ConclusionThe two neurodegenerative diseases SCA3/MJD and PD show the similar abnormal phenotypes and the mitochondrial dysfunction.The similar pathogenisismay raise the theoretical basis for“the same cure for different diseases”.

SCA3/MJD;PD;mitochondria;Drosophila

Q 5;R 741

A

1000-1492(2016)03-0341-05

时间:2016/1/28 14:23:10 网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.014.html

2015-12-29接收

国家自然科学基金(编号:81360488、81160163);广西自然科学基金项目(编号:2012GXNSFAA053104、2013GXNSFAA019110);广西壮族自治区研究生教育创新计划资助项目(编号:YCSZ2014208)

1桂林医学院临床学院,桂林 541004

2桂林医学院附属医院神经内科,桂林 541001

崔 莹,女,硕士研究生;

陈梅玲,女,副教授,硕士生导师,责任作者,E-mail:cmmling@sina.com.cn

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