郑学军,阮海玲,杨金良,罗寰,任占芬,赵亚君

(河北北方学院附属第一医院风湿免疫科，河北 张家口 075000)



调节性B细胞与自身免疫性疾病研究进展

郑学军,阮海玲,杨金良,罗寰,任占芬,赵亚君

(河北北方学院附属第一医院风湿免疫科，河北 张家口 075000)

关键词：B淋巴细胞；调节性B细胞；免疫调节；自身免疫性疾病

B淋巴细胞在机体的适应性免疫反应中发挥着重要作用，主要通过产生抗体、提呈抗原和产生细胞因子(如IL-4、IL-6等)发挥免疫调节作用。但是，机体内也存在着一种数量虽少但功能独特且能发挥免疫抑制功能的B淋巴细胞，研究人员将这种B细胞称为调节性B细胞，功能缺失可导致自身免疫系统平衡紊乱，引起自身免疫疾病。现就调节性B细胞功能、标记物和相关自身免疫疾病进行综述。

1调节性B细胞的发现

1996年有学者于实验性自身免疫性脑脊髓膜炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)的模型中提出B细胞存在负向免疫调节功能[1]。自此，此型B细胞亚群正式引起研究者关注。1997年，Mizoguchi等正式提出了“调节性B细胞”这一新名词，并在炎性肠病(inflamlnatorybowel disease，IBD)小鼠模型中发现了调节性B细胞存在的有力证据[2]。在之后的研究里，学者们陆续在更多的小鼠模型中证实B细胞参与免疫调节和免疫抑制，Miyagaki等在B细胞缺陷小鼠EAE模型中发现B细胞经脂多糖刺激后可以减缓免疫进程，并能通过分泌细胞因子IL-10抑制过度炎症反应[3]。有研究者在小鼠EAE模型中验证了B细胞可以分泌IL-10，并调节CD4+、CD25+T细胞减轻疾病对机体的损伤。近年来不断有研究证明人体内也有调节性B细胞的存在。2010年Zhu XM等首次报道了人类外周血中的调节性B细胞，表型为CD19+、CD24+、CD38+细胞，主要以浓度依赖和接触依赖的方式显著抑制CD4+T细胞的表达，抑制促炎症因子的分化[4]。2013年Fumzawa-Carballeda等在实验中证实CD19+、CD24+、CD38+B细胞可以分泌IL-10。Noh等认为CD19+、CD5+、Foxp3+B细胞可能为人体内潜在的调节性B细胞亚群。之后，在多发性硬化等多种疾病患者体内均发现分泌产生IL-10的调节性B细胞数量减少。小鼠调节性B细胞的抑制作用主要依赖IL-10，但并非绝对依赖IL-10。与之相反的是，Yan SX等学者则认为，人类表型为CD19+、CD24+、CD38+细胞的调节性B细胞经过CD40的刺激后，可以抑制Th1的分化，并且主要是通过IL-10的分泌完成此抑制作用，而并不依赖TGF-β[5]。近年来，大量研究证明，调节性B细胞可以调节CD4+T细胞的分化，Ding T等通过实验发现，健康人体内的CD19+、CD24+、CD38+细胞可以分泌IL-10，抑制原始辅助T细胞向Th1/Th2分化[6]。调节性B细胞无论在体内还是体外均可影响CD4+T细胞的进一步分化，不仅影响Th1/Th2而且影响Th17/调节性T细胞的分化，所以，有理由相信调节性B细胞在许多疾病中发挥重要的负性免疫调控作用。

2调节性B细胞的标记和种类

调节性B细胞在不同的种属表型不同，不同的疾病中表型也不同，目前尚无统一定论。有关人类调节性B细胞的研究应用最多的细胞表面标记为CD19、CD5、CD24、CD38、CD27、IL-10等。调节性B细胞的种类众多，研究者依据其起源及分泌的细胞因子的不同，将调节性B细胞分为3大类：①产生IL-10的相关调节性B细胞(来源于Br1)，又称为B10细胞，调节性B细胞分泌的IL-10通过抑制Th1和Th2细胞的极化，调节Th1/Th2平衡，并可以抑制单核细胞和巨噬细胞产生促炎性细胞因子和趋化因子，还可以抑制MMP、IL-1的释放，促进IL-l受体拮抗剂产生；②产生TGF-β的相关调节性B细胞(来源于Br3)，调节性B细胞可以通过分泌TGF-β诱导效应性T细胞凋亡，该类调节性B细胞与B10细胞的不同之处是在体内不扩增；③表达转录因子Foxp3的相关调节性B细胞，研究者认为该类细胞是与调节性T细胞(CD4+、CD25+、Foxp3+T细胞)相对应的一类调节性B细胞。

3调节性B细胞的活化

调节性B细胞的分化和激活方式大致分为2种：固有性和适应性。在早期的固有免疫中B1细胞和边缘区B细胞(marginal zone B cells，MZB)可以不依赖T细胞发挥作用，滤泡B细胞(follicular B cells，FOB)则在T细胞帮助下调节适应性免疫。在B细胞亚群中，B1α、FOB、MZB和T2．MZP(边缘区前体B细胞表型)等亚型细胞均可以分泌IL-10，发挥负向调节作用，调节性B细胞需要细胞间信号的激发才能发挥生物学效应。Kim SJ等将诱导调节性B细胞活化的信号分为内源性和外源性2种[7]。刺激分子CD40作为内源性信号在T细胞介导的B细胞活化中至关重要，CD40-CD40L的相互作用可以引起自身免疫病小鼠模型中的调节性B细胞活化，免疫调节作用增强。已有研究证实MZB细胞在Toll样受体激动剂的诱导下可以产生IL-10，减缓疾病进展。

4调节性B细胞的功能

4.1抑制炎症过度反应

调节性B细胞在炎症微环境下通过分泌IL-10、TGF-β等抑炎性细胞因子发挥免疫调节作用。IL-10可抑制巨噬细胞和树突状细胞活化，减少其分泌促炎细胞因子，抑制CD4+T细胞增殖，进而下调Th1/Th2细胞平衡，但此功能可能需要IL-21的参与及CD40与T细胞之间的相互作用。而负性免疫调节因子TGF-β能抑制多种免疫活性细胞的增殖和分化，并可抑制多种炎症因子如IL-2、INF-1的分泌，通过调节Th17/调节性T细胞平衡来抑制疾病进展。

4.2调节T细胞增殖

研究证实调节性B细胞不仅可以通过Fas/FasL介导的凋亡机制抑制效应性T细胞的增殖，还通过直接的主要组织相容性复合体(MHC)和B7共刺激分子途径促进调节性T细胞的分化和增殖，进而抑制免疫反应。

4.3中和毒性物质

调节性B细胞还可中和毒性物质，加速清除具有自身抗原活性的凋亡小体。

5调节性B细胞与系统性红斑狼疮(SLE)

SLE是由于患者体内免疫耐受异常和B细胞发育过程中存在轻重不一的缺陷，从而导致体内自身反应性B细胞显著增多，产生以ANA和抗dsDNA抗体为代表的多种自身抗体，并随着病程进展免疫复合物沉积于组织、脏器而发病。传统研究认为，B细胞是SLE发生、发展的“始作俑者”，但是调节性B细胞负向免疫调控机制的发现及深入研究逐渐改变了此观点。新近的研究表明，功能各异的B细胞亚群贯穿于SLE发病的不同时期，调节性B细胞在SLE发病早期发挥保护作用，而效应性B细胞主要在SLE发病过程中发挥致病作用，B细胞及其亚群与SLE的发生、发展密切相关。研究证实SLE患者体内存在明显的免疫细胞网络失调，其中以Th细胞亚群的失衡最为关键，Th1/Th2细胞比值上调及Th1细胞的优势程度与SLE疾病活动度密切相关。调节性B细胞分泌的IL-10可以下调炎性细胞因子分泌，抑制炎症级联反应，恢复Th1/Th2细胞失衡，抑制疾病的进程及转归。IL-10可有效抑制效应性T细胞和抗原递呈细胞，还可抑制体内炎性因子的产生。研究证实，SLE患者体内存在调节性B细胞的功能被抑制甚至失活。Blair等由竞争性抗CD40抗体活化后的调节性B细胞转移到MRL/Ipr(SLE动物模型)小鼠体内，发现调节性B细胞可明显改善小鼠的肾病症状，提高小鼠的存活率。Presa等[8]证实CD19+、CD24+、CD38+B细胞的抑制功能与IL-10、CD80和CD86有关，而不依赖于TGF-131，提出SLE患者中该类亚群细胞存在功能缺陷，分泌IL-10减少，不能抑制效应性T细胞产生致炎因子，致使Th1细胞因子增多，SLE病情加重，从而证实CD19+、CD24+、CD38+B细胞在SLE的发病中发挥至关重要的作用。

人体内调节性B细胞并非单一依靠IL-10发挥调节作用，研究提示SLE的发生发展可能与淋巴细胞亚群之间的复杂免疫调控有关。Lykken等[9]认为调节性B细胞存在于SLE患者外周血和受累皮肤中，在实验中发现SLE患者外周血循环中调节性B细胞的比例增高，且其分泌IL-10的能力增加。SLE复发时调节性B细胞比例增加，当疾病缓解时降低，并且其比例增加与滤泡辅助性T细胞(T follicular helper cells，Tfh)在体内的扩增有关，而Tfh细胞来源的IL-21能够促进调节性B细胞分化及IL-10的产生。该研究提示Tfh细胞和B细胞亚群共同参与了SLE的发生发展。

6调节性B细胞与RA

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以慢性、对称性、多关节非化脓性炎症为主要表现的全身性自身免疫性疾病，可伴关节外损害，如血管炎、心包炎、肺间质纤维化、周围神经炎、皮下结节及眼部疾患等。晚期关节可出现不同程度的强直和畸形，丧失关节功能，致残率高。多见于中年女性，我国患病率约为0.32%～0.36%，约有41%的患者在发病1年后出现骨侵蚀。对调节性B细胞与RA关系的认识，首先源自于CIA小鼠的研究，关于CIA的研究证实了B10细胞的负向调节作用及治疗潜能。Liu X等[10]研究发现向CIA鼠体内注射已活化的野生鼠B细胞可抑制Th1 细胞的分化及关节炎的进展，而注射来源于IL-10缺陷鼠的B细胞则未发现此抑制功能。同样，从关节炎小鼠脾细胞分离的B细胞在体外被anti-IL-10/anti-IL-10R处理后，则不能阻止受体小鼠关节炎的发展。Zhang J等[11]研究发现，向CIA鼠体内注射调节性B细胞后，CIA小鼠本身体内的调节性B细胞也会相应增加，这些调节性B细胞为在脾脏中高表达CD21、CD23和IgM的T2-MZP B前体细胞，这群细胞在正常小鼠体内分泌IL-10较少，但在炎症环境刺激下数量会大大增加。向CIA鼠注射来源于疾病缓解期DBA/1鼠的CD21hiCD23+IgM+B细胞，能通过IL-10的分泌抑制CIA进展，减轻疾病的严重程度。最近研究表明,调节性B细胞可以抑制Th17细胞介导的自身免疫性关节炎，并且能抑制Th17的增殖和分化。在CIA小鼠的脾脏和引流淋巴结中，调节性B细胞数量明显降低，Th17细胞数量明显增加。然而，给予体外扩增的CD1dhiCD5+B细胞后，Th17细胞数量减少。将CD1dhiCD5+B细胞与幼稚CD4+T细胞体外共培养发现CD4+T分化受抑制，增殖减少。而且，过继转移Th17细胞于IL-17-/-DBA/1鼠能诱导CIA。进一步研究显示，CD1dhiCD5+B细胞体内输注给CIA小鼠后可有效抑制CIA的进展，缓解临床症状，减轻关节组织损伤。并通过体内定位显示发现输注的CD1dhiCD5+B细胞可聚集在关节中。另一项研究表明，与野生型小鼠对照，缺乏B10嵌合体小鼠关节炎进展更迅速，调节性T细胞数量显著减少，Th1和Th17细胞数量显著增加。进一步研究发现调节性T细胞的诱导与T2-MZP调节性B细胞有关，将WT小鼠的T2-MZP调节性B细胞过继性转移给患有关节炎的IL-10-/-小鼠可增加Treg的数量和减少Th1与Th17细胞的数量，最终使这些细胞的数量和野生型小鼠的水平相当，从而抑制了炎症反应。关于CIA小鼠的研究表明调节性B细胞在阻止关节炎的发生发展中发挥了重要作用。

7调节性B细胞与炎症性肠病(inflammatory bowel disease IBD)

在研究IBD发病机制时发现Bregs参与疾病的发生发展。IBD是一种自身免疫性疾病，以肠道炎症及肠黏膜损伤为主要特点，免疫功能紊乱在IBD的发生发展中起重要作用。主要包括两类，第一类由Th1途径介导，称作克罗恩病(CD)，为IBD的主要类型，并主要由Tregs调节；第二类即UC，由Th2途径介导。Mizoguchi等以TCRa敲除(TCRa KO)的小鼠作为模型，可以观察到伴随着UC的发生，小鼠体内产生自身抗体，这一点初步证实了B细胞在这种疾病中具有病原性，但对比缺乏B细胞的TCRat双敲除(TCRatⅡD KO)小鼠，TCRa KO小鼠的炎症要轻得多，在一定程度上证明了B细胞也可能在调节UC中起到积极的作用。为证实这种作用，Dumoitier等[12]将TCRa KO小鼠体内外周B细胞转移给3～4周龄的TCRat ⅡD KO小鼠，能够发现后者的UC恶化趋势明显减缓，同时，如果将TCRa KO小鼠体内的成熟B细胞移植给已发生UC的TCRa ⅡD KO小鼠身上，会显著减少后者体内具有致病性的CD4+TCRa-8+T细胞。而且，相比其它疾病，Bregs在UC中的作用似乎更明显。向BALB/C小鼠或裸鼠(nu/nu)植入Tregs缺失的T细胞，可引起自发性的胃炎、甲状腺炎、卵巢炎及睾丸炎等疾病，但不会出现UC。而对于缺乏B细胞的SCID小鼠来说，植入Treg缺乏的CD4+T细胞后会出现复发性的UC症状。这就进一步证明了B细胞在调节UC中的作用。

8调节性B细胞与自身免疫性糖尿病

B淋巴细胞不是仅分泌自身抗体的被动效应性细胞，其在调节细胞免疫应答过程中也发挥重要作用。B淋巴细胞反应失调可能导致免疫反应的衰减，从而导致自身免疫性疾病的发生。在脾脏中发现的边缘性B细胞(MZB细胞)可能在活化初始的CD4+T细胞中发挥重要作用。NOD小鼠在5周龄时较B6小鼠可以检测到更多的MZB细胞。除脾脏外，NOD小鼠的胰腺淋巴结(PLNs)及胰腺中也存在MZB细胞。这些MZB细胞能够加工及提呈胰岛素，被认为是PLNs中的主要自身抗原提呈细胞。Kim等[13]对NOD小鼠胰岛中浸润性B淋巴细胞的研究显示，B淋巴细胞可以刺激T细胞的活化。胰岛中的浸润性B细胞被归为第三级淋巴结构(tertiary lymphoid structures，TKS)，TLs在糖尿病发生中不是必需的，因为在趋化因子CXC配体13(CXCLl3)缺陷即破坏了TLS结构的小鼠中，B细胞受体的多样性及糖尿病的发生并未受到影响。TLS具有生发中心，其中的B淋巴细胞有着不同的轻链。这使胰岛中的B淋巴细胞较PLNs有着更强的免疫反应，并能增强抗原活性。这些发现为胰岛中存在T-B细胞相互作用提供了证据。另一些研究提示，胰岛素不是对外周蛋白有反应性的胰岛浸润性B淋巴细胞识别的唯一抗原。胰岛中T-B细胞相互作用对维持CD4+T细胞的活性及致病性是必需的。然而，研究发现活化的B淋巴细胞却对T1DM起维持耐受和提供保护的作用。在小鼠5～6周龄时重复静脉输注1.2×10 7个接受过B细胞抗原受体(BCR)刺激的NOD小鼠脾脏B淋巴细胞，既可以延迟T1DM的发病时间又可以降低发病率。在小鼠9周龄时开始治疗只能延迟T1 DM的发病时间。研究显示这种效应是IL-10依赖性的，因为输注活化的IL-10-/-B淋巴细胞不能阻止NOD小鼠发生T1DM。输注活化的B淋巴细胞的治疗作用与CD4+T细胞向Th2型细胞转变有关。提示存在可能：治疗性输注自体调节性B淋巴细胞可能减少T1DM高危人群发生糖尿病的风险。Dhaeze研究显示[14]，用脂多糖激活的B淋巴细胞作用于NOD小鼠能上调FasL水平并使TGF-β分泌增加，从而抑制自身免疫性糖尿病的发生。与IL-10分泌型调节性B细胞不同，TGF-β分泌型调节性B细胞虽然可以在体外成功诱导，但在体内是不存在的。因此体外诱导分泌TGF-β的调节性B细胞可以为自身免疫性糖尿病的治疗提供新方法。

去除B淋巴细胞治疗自身免疫性糖尿病对调节性B细胞影响T1DM时β细胞破坏的免疫发病机制与T淋巴细胞的自身免疫相关，B淋巴细胞在许多T淋巴细胞介导的疾病中同样发挥着重要作用。B淋巴细胞作为抗原提呈细胞，高表达与主要组织相容性复合物Ⅱ类分子结合的抗原，通过表位扩展将抗原多肽的内隐表位提供给非耐受的T淋巴细胞识别，从而在发病机制中发挥重要作用。抗CD20单克隆抗体(利妥昔单克隆抗体，ritux—imab)能选择性的衰减B淋巴细胞。给予利妥昔单克隆抗体后，B淋巴细胞的暂时性消除能减缓自身免疫介导的胰岛β细胞的破坏。将利妥昔单克隆抗体作用于表达人CD20(hCD20)的转基因小鼠时发现，在4～9周龄去除B淋巴细胞可以使一部分小鼠延迟或避免发生糖尿病。在发病后再给药，35%的小鼠糖尿病出现逆转，并可维持较长时间。

9调节性B细胞与多发性硬化(MS)

MS的主要特点是主要累及中枢神经系统(CNS)白质炎性脱髓鞘病变，其病理特征是髓鞘崩解和脱失、少突胶质细胞变性增生及血管周围炎性细胞浸润。其病因和发病机制复杂，一般认为与免疫、病毒感染、遗传等因素有关。EAE的病理变化和发病机制与MS极其相似，为MS的研究提供了可靠的动物模型。

Yousefi的动物研究发现[15]，B细胞缺失尤其是Bregs缺失，可导致髓磷脂碱性蛋白(MBP)肽所致EAE加重，无法像正常小鼠一样自发性缓解。同时uMT小鼠(B细胞成熟功能缺陷)比野生型小鼠病情更严重，而且不能完全恢复。因此，推测B细胞参与了EAE的疾病缓解过程。后来研究发现B细胞可以通过B7H诱导共刺激分子(ICOS)选择性出现于活化Tregs,并通过B7H与ICOS的相互作用促进T细胞产生IL-10和CD4+、CD25+Tregs的形成，抑制EAE加重。同时，B细胞中髓样分化抗原88(MyD88)信号可促进EAE的恢复。Fillatreau等发现B细胞缺失的小鼠发生EAE，且用髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)免疫后没有缓解，而对照组小鼠通过MOG免疫相关的CD40刺激B细胞产生IL-10而使疾病康复。Baba研究[16]发现B细胞在TLR激动剂刺激下产生的IL-10及B细胞的TLR信号均可抑制Th1和Th17细胞介导的炎症应答，聪而促进EAE的恢复。

Miyagaki等研究[17]发现，在EAE起始阶段利用妥昔单抗去除B细胞后，小鼠并没有因为B细胞减少、抗体产生减少而出现临床症状的减轻，相反表出更为严重的病理表现。在疾病起始阶段，这群细胞在脾脏内迅速扩增，与其调节作用平行。但是，一旦患上EAE，B10细胞并不能抑制进展阶段的EAE。相反，Tregs在疾病进展阶段显著扩增，与晚期病程的负性调节平行，消除Tregs加重晚期病程。因此，提示B细胞优先控制疾病的启动，而Tregs主要是控制疾病的晚期进展[14]。另外，B细胞转移可引起EAE小鼠CNS中Tregs转录因子P3(Foxp3)表达呈IL-10依赖性增加，单B细胞和Foxp3+Tregs是重叠还是独立发挥作用影响EAE的免疫过程尚未得到明确。

在MS等自身免疫疾病中，Bregs比健康对照组明显减少，在疾病恶化时，幼稚/记忆Bregs比例降低[15]。2010年Ochoa-Repáraz等[16]发现通过口服抗生素治疗EAE，可诱导肠道相关淋巴组织(GALT)中CD5+B细胞亚群增殖。通过转移抗生素诱导产生的CD5+B细胞治疗EAE，其通过改变Th1/Th17的比例来增强Th2型免疫反应，显著减轻EAE严重性。在怀孕期间可增强缓解MS，提示提高雌激素(E2)水平可以发挥免疫调节作用。

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[责任编辑：李蓟龙]

DOI：10.3969/j.issn.1673-1492.2016.04.026

中图分类号：R 392

文献标识码：C

作者简介：郑学军(1972-)，男，河北献县人，副主任医师，研究方向：高尿酸血症诊治研究。

来稿日期：20160317