孟 娟，郑西来，王玉华，撒占友

（1.中国海洋大学 环境科学与工程学院，山东 青岛 266100；2.青岛理工大学 安全工程系，山东 青岛 266520）

石油污染海岸线生物修复技术研究进展

孟 娟1，2，郑西来1，王玉华2，撒占友2

（1.中国海洋大学 环境科学与工程学院，山东 青岛 266100；2.青岛理工大学 安全工程系，山东 青岛 266520）

介绍了生物修复、生物强化和生物刺激的基本概念。综述了基于生物强化和生物刺激技术处理石油污染海岸线的研究进展，并指出不同处理技术的优势与不足。分析了影响溢油污染海岸线生物修复的重要因素，包括石油类型、波浪和水流能量、温度、盐度、氧气含量等。对今后研究的主要方向进行了展望。

生物修复；生物强化；生物刺激；石油污染土壤；海岸线

随着全世界工业化进程的推进，对石油资源的需求也日渐增多。目前世界各地在石油开采和运输等环节的溢油事故频发［1-2］。溢油中因含有毒性有机成分，严重危害整个海洋生态系统，也会因生物放大作用危及人类健康［3］。海上溢油随风浪被带到海岸线之前，已经历各种衰减（风化）过程，包括蒸发、光化学氧化和生物降解等，石油的物理化学性质与初始泄漏状态相比已发生极大改变［4］。抵达海岸线的石油，无论污染还是危害程度以及清除难度都要比在海上大很多［5］。对石油污染物的治理方法有物理法、化学法、生物法等，其中对污染土壤的生物修复法因具有高效、环境友好、成本低等优点，被认为是一种极具成本效益的绿色治理技术［6-8］。

本文在阐述生物修复（Bioremediation）、生物强化（Bioaugmentation）和生物刺激（Biostimulation）的基本概念的基础上，综述了生物强化和生物刺激技术的应用现状，介绍了影响溢油污染海岸线生物修复的重要因素，并在此基础上指出了今后研究的主要方向。

1 生物修复的概念、分类及应用

石油污染土壤的的生物修复是指借助微生物具有可利用碳氢化合物为碳源和能源的自然能力，通过微生物的代谢活动来降解土壤中的石油污染物，减少石油污染物浓度或使其无害化的过程［9］。石油中大多数化合物是可被微生物降解的，但其自

然降解是一个缓慢的过程，因此研究加速其自然衰减（也称内在生物修复）的技术极为重要［10］。

目前加速污染土壤内在生物修复的主要应用形式有两种：生物强化和生物刺激。生物强化是指向污染土壤中接种污染物降解菌群以提高污染物的生物降解率；生物刺激则是指通过向污染土壤中添加营养物质（主要是N和P）或生物表面活性剂等刺激土著污染物降解菌群生长或其降解活性的制剂，以提高污染物的生物降解率［11］。

1.1 生物强化

微生物被认为具备使用石油作为碳源和能源的新陈代谢机能和酶能力［12-13］。研究表明，以降解石油烃能力著称的典型菌群在自然环境中广泛存在，包括假单胞菌、海杆菌、食烷菌、产微球茎菌、鞘氨醇单胞菌、红球菌、微球菌、纤维菌、迪茨菌、戈登氏菌等［14-16］。由于石油是一种复杂的多组分均质混合物，其主要组成元素C和H可按一定数量和空间关系结合成多种石油烃（烷烃、环烷烃、芳香烃等）［17］。不同微生物对不同石油烃的降解效果存在明显差异，如菌株JZ3-21（恶臭假单胞菌Pseudomonas putida）对正十六烷的降解率高达99.77%，同时对芘的降解率仅为23.70%，菌株B5（施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri）则具有良好的芘降解性能，培养36 h内对芘的总降解率高达96.3%［18-19］。因此在溢油污染发生时，往往需要多种微生物协同作用才可完成对全部石油组分的降解。混合菌群的降解能力往往优于单一菌株，如何构建高效石油降解混合菌群已成为石油污染土壤生物修复的重要研究内容［20-21］。包木太等［22］从青岛港口海水中筛选出4株适宜海洋环境的高效烃降解菌，菌种鉴定结果表明它们分别为脂肪杆菌属、海球菌属、微杆菌属和动性球菌属；分别对单株菌和不同方案混合菌（2株菌、3株菌和4株菌）的原油降解能力的考察结果表明，4株菌混合时原油降解能力最强。崔志松等［23］基于海洋石油降解菌群DC10（2株食烷菌Alcanivorax sp.和1株海杆菌Marinobacter sp.），通过分别发酵制备成复合菌液并检验其在实验室模拟溢油岸滩条件下的除油能力，实验结果也表明，添加复合菌液可有效提高石油烃降解率，在复合菌液配合可溶性营养盐处理28 d后，石油烃降解率较自然风化组提高约25%左右。

按照所接种的石油烃降解菌筛选途径的不同，采用生物强化法向石油污染区接种的石油烃降解菌主要有两种：1）外源微生物；2）土著微生物。

培养外源微生物的方法是从现有微生物标本库中筛选石油烃降解微生物或微生物菌群，经放大培养制成菌剂，投加到石油污染土壤中。尽管外源微生物在实验室研究中已取得一定成果，但目前这仍是一种极具争议性的方法，因为向环境中添加外源微生物，意味着可能会给环境和微生物自然多样性带来未知影响［24］。迄今为止，大部分污染区的实地研究结果表明，对于多数环境，从长远来看，该法并不能显著有效地提高石油的生物降解率［25］。这是因为：在实验室条件下接种微生物菌群所需的营养物质丰富易得，而现场条件中营养物质的浓度则往往不能充分保证；外源微生物也无法快速适应实地环境条件，不能在与土著微生物的竞争中占据优势［26］。

越来越多的证据表明，克服外源微生物固有缺陷的最佳方法是土著生物强化（Autochthonous bioaugmentation，ABA），即只使用来自污染区的土著微生物清除污染物［27］。ABA法使用土著微生物菌群，可使微生物更快速且长期地适应污染环境，对土壤生物修复的效果好，已逐渐成为目前生物强化研究的重点［28-29］。Pasumarthi等［9］利用柴油作为唯一碳源，从印度果阿海岸石油污染区沉积物中成功筛选出2种自然存在的土著微生物：假单胞菌和弗格森埃希菌，并将它们接种至无菌锥形摇瓶（内置石油污染区沉积物、质量分数3%的NaCl、布氏-哈斯介质等）中，以研究它们对石油烃的降解能力，色谱分析结果表明，在120 h后石油的生物降解率即可达到43%，这说明利用土著微生物可实现较好的生物修复效果。研究结果同时表明，微生物对不同组分烃显示出不同的降解性能，如正烷烃的降解速率高于多环芳烃，而在多环芳烃中，未烷基化多环芳烃的降解速率高于烷基化多环芳烃。

此外，微生物的添加方式也会影响生物修复效果。由于固定化微生物对污染土壤的修复效果明显优于游离微生物，因此在海水体系中对微生物采取固定化处理已成为充分发挥微生物降解作用的有效技术手段［30］。固定化微生物技术是通过物理或化学方法将游离微生物限制或定位在特定空间范围内，因此可有效保持微生物的密度和活性，从而提高污染土壤的生物修复效果［31］。目前制备固定化

微生物最常见的方法为吸附法，常用载体有无机载体（活性炭、硅藻土、膨润土等）、天然有机载体（海藻酸盐、甲壳素、壳聚糖等）、合成高分子载体（聚乙烯醇、海绵、聚氨酯泡沫等）和复合载体（有机载体和无机载体的组合）4类［32］。Lee等［33］以泥炭、膨润土和藻酸盐制成复合载体，固定混合菌群并研究其除油效果，实验结果表明30 d后柴油去除率高达99.9%。许振文等［34］以海藻酸钙为载体，包埋固定降解菌ZW8（铜绿假单胞菌）并进行降解蒽的研究，实验结果表明，固定化技术拓宽了ZW8对pH和温度的适应范围，可有效增强ZW8对蒽的降解能力。

1.2 生物刺激

生物刺激主要措施有两种：1）添加营养成分；2）添加生物表面活性剂。

1.2.1 添加营养成分

C，N，P是微生物新陈代谢必须的营养元素［35］，n（C）∶n（N）∶n（P）最佳值为100∶10∶1。而在石油污染区，C元素含量远远高于N和P，因此易造成生物降解过程中营养元素的比例失调，从而导致微生物对石油烃的降解活动受限［16，36］。营养物质的缺乏是阻止或减缓海岸生态系统生物降解率的一个重要因素［37-39］。在目前相关的研究中，向海岸线溢油污染环境中添加营养成分的类型主要有3种：1）无机营养物质；2）有机质；3）亲油性肥料和缓控释肥料。

已有研究表明，添加无机营养物质（NH4NO3、Na2HPO4、KH2PO4等）可以显著刺激石油烃降解菌的生长和代谢，从而提高石油污染沉积物的生物降解率［40-42］。然而随着研究的不断深入，无机营养物质的应用缺陷逐渐显露。向开放的海滩环境投加水溶性的无机营养物质通常是不切实际的，因为水溶性养分极易在潮汐作用下迅速稀释和流失［43］。为保证养分浓度维持在理想范围，可选择不断重复添加水溶性养分。然而这种方案不但会增加成本，还可能导致富营养化，进一步对已受污染的环境产生危害，对整个沿海生态系统产生负面影响［44］。广泛的营养补充还可能反而减缓生物降解过程，因为加入过多的尿素（无机N），可能会将n（N）∶n（H2O）提升到过高水平，也会使环境pH高于中性水平，这些都会对微生物的生长产生负面影响［45］。因此添加无机养分N和P已非生物刺激治理方案首要选项。目前人们更多地致力于研究对沿海生态系统相对安全有效的营养物质，如有机质、亲油肥料和缓控释肥料。

Behzad等［46］的研究表明，向石油污染沉积物中添加少量的有机质-胆碱衍生物（如枸橼酸胆碱（TCC）、月桂酰氯化胆碱（LCC））即可显著增加石油污染沉积物中解烃菌群（包括总石油烃（TPH）降解菌群，烷烃降解菌群和多环芳烃（PAH）降解菌群）的丰度。这说明胆碱可作为C源和N源被石油烃降解菌群利用，而有机质只需少量使用即可达显著效果，因此环境面临的富营养化风险将显著降低。研究结果同时表明，LCC还兼有表面活性剂的功效，通过减小油滴尺寸，可增加油与细菌接触的表面积而提高生物降解率。Agota等［47］的研究取得了类似的结果。

亲油性肥料和缓控释肥料的优势则在于，它们与水体接触时可在一定时间内持续或间断释放养分，在潮汐作用下养分流失少，同时也不会引发短时营养物质浓度过大而导致的富营养化风险。这种类型的肥料代表如商业产品Inipol EAP 22、S200已被广泛应用于现场溢油治理，亲油性肥料Inipol EAP 22被证明是潮间带岩石区溢油污染治理的最佳选择［48］。

1.2.2 添加生物表面活性剂

添加生物表面活性剂可显著增加石油的生物降解率［49］。这是因为生物表面活性剂（如鼠李糖脂）的加入可增加微生物对石油的利用度。石油的生物利用度是影响溢油污染环境生物修复率的关键因素。由于石油的疏水性和低水溶性特点，决定其具有的生物利用度较低［50］。有研究表明，石油生物降解率与其生物利用度之间存在线性相关关系［51］。Aburto-Medina等［52］采用生物强化策略修复长期受油污染土壤，只可清除约41.3%±6.4%的C10～C40石油烃，这是因为尽管C15～C36石油烃被认为是可生物降解的，但受生物利用度制约，生物修复过程结束后它们仍可能在环境中大量残留。溢油污染海岸线的石油由于与环境接触时间长，受不同程度的风化作用，其生物利用度和生物降解性更低［53］。这是因为随着时间的推移，污染物已发生老化，并通过有机物质扩散或吸附到矿物表面等过程，导致碳氢化合物发生封存，从而降低了石油的生物利用度，最终表现为石油在环境中的残留和生物修复的低效率［54］。生物表面活性剂提高石油生物利用度的机理在于乳化油-水混合物，提高石油

烃的水溶性，由此促进微生物对石油烃的吸收和同化，最终促进石油生物降解［55-56］。

1.3 生物强化和生物刺激联合修复

在生物修复过程中只采用单项技术措施往往存在修复效果不佳的缺点。McKew等［49］的研究结果表明，单独添加生物表面活性剂（鼠李糖脂）几乎未对生物降解产生影响，而生物表面活性剂（鼠李糖脂）结合水溶性养分可显著增加生物降解率。这是因为，单独添加生物表面活性剂只提高了石油组分的生物利用度，而如果必要的营养物质（N，P）缺乏，微生物活动仍将是受限的。Hosokawa等［24］的研究结果则表明，生物刺激法（添加营养物质）的有效性虽被认可，但仍需要较长时间才能够成功，这可能是因为可降解石油烃的土著微生物缺乏。

目前，结合生物强化和生物刺激互补特点的联合修复技术，成为海岸线溢油污染生物修复的研究热点和重要内容［57］。Nikolopoulou等［58］在一个为期90 d的实验研究中，对比测试了土著微生物菌群处理石油烃的自然衰减处理组、养分添加处理组、养分和生物表面活性剂（鼠李糖脂）添加处理组的石油生物降解率，实验结果表明，养分和生物表面活性剂（鼠李糖脂）的加入均有助于增强生物降解过程，但与其他处理组对照，NPKMR组（土著微生物群+无机氮磷钾养分+鼠李糖脂）的降解效果最显著，在15 d内正烷烃降解率即达到99%。

2 影响溢油污染海岸线生物修复的重要因素

尽管生物修复法被广泛使用，但其有效性仍有待商榷［59］。特别是应用生物修复技术进行原位/原地修复试验时，所得数据与实验室数据的一致性常无法保证［60］。这是因为石油的生物降解过程受很多因素影响，如石油类型、波浪和水流能量、温度、盐度、氧气供应量等［61］。

2.1 石油类型

石油的物理特性会极大影响污染物生物降解的速度。不同类型的石油其环境行为、存留持久性、毒性等亦不同，因此对海滩环境造成的危害和影响程度也有很大区别。基于文献和以往溢油事故案例，本文主要探讨3种类型的石油：1）轻质精炼油；2）轻质、中质原油；3）重质原油和重质成品油。

轻质精炼油如喷气燃料、煤油、柴油等具有较低的黏度和相对较高的水溶性、蒸发损失率，其生物利用度较高，这类石油制品已被证明对环境生物具有最高的急性毒性反应，会毒害植物和动物，也可能会因其非极性性质而伤害微生物的细胞质膜，扰乱磷脂的双层结构［62］。轻质精炼油即使在轻到中等程度的海浪能作用下也可以较高程度地分散到水体中，因此当其泄漏在海洋环境中时，通常延展成薄层或以浮油形式存在，不会长期存留而导致严重的海岸线溢油污染［63］。

轻质、中质原油具有相对短期的急性毒性，根据其化学成分以及在海岸线环境滞留前的风化程度不同，其对海岸线产生的影响亦极为不同［64-65］，因此目前要总结轻质、中质原油对海岸线影响规律尚存在一定困难。

重质原油（包括提取自油砂的原油）和重质成品油（如重燃油）中含有的严重有毒化合物较少，通常以物理作用（如形成涂层）或窒息作用危害海岸线及环境生物。研究表明，重质油溢油事故一旦发生，往往会对海岸线生态环境造成长期（2 a以上）影响，污染程度严重，这是因为该类溢油极易在表面砂层处形成厚涂层，同时渗透进入砂层深处，成为埋藏油［63］。

2.2 波浪和水流能量

美国海洋与大气管理局在《典型沿海栖息地溢油响应方案》［66］中指出，波浪和水流的作用会产生机械能，海岸线在这种机械能中的暴露程度是决定海岸线敏感性和滞留油持久性的关键因素。

随着波浪和水流能量的减少，石油在海岸线的停留时间将增加。对于低能海岸线环境，往往需要辅以生物修复处理技术以加速石油的生物降解。但为避免过度处理给海岸线生态环境带来二次污染，采取生物修复处理技术时还应充分考虑石油的自然清除速度随所处物理位置不同而产生的相对差异，如位于海岸线边缘地带的石油在波浪和水流能量作用下的自然清除速度较快，而内部石油通常需要加以生物修复处理。2010年的深水地平线石油泄漏事件导致美国路易斯安那州796 km海岸线被石油污染，然而仅有71 km海岸线被批准可采取措施加以处理。统计数据表明，1年后被污染海岸线长度即缩短至258 km，3年后被污染海岸线长度缩短至141 km，其中仅有5.6 km被界定为中度或重度污染区［67］。

2.3 温度

温度是控制石油降解率的重要因素。温度对石油生物降解过程的影响主要体现在以下3个方面：1）直接影响石油烃的物理化学特性，如黏度、扩散性和挥发性等，并由此影响石油的生物利用度［68-69］。2）影响石油烃降解菌的多样性和活跃度，而后者在生物修复过程中起至关重要的作用。Abed等［70］研究不同温度下（10，30，50 ℃）石油污染土壤的生物修复效率，实验结果表明：随温度升高，细菌呼吸作用增强，这说明细菌在高温下活跃度增加；随温度升高，还检测到新的菌群出现，且新菌群为石油降解菌群，这说明细菌在高温下生物多样性增加。3）升高温度还可以刺激参与石油降解过程细菌的酶活性［71］。

2.4 盐度

环境盐度也会影响石油的生物降解过程。盐度变化对石油生物修复效率影响较为复杂。一方面随盐度增加细菌呼吸会显著减少，菌群活跃度将降低［70］，这是因为许多微生物对离子强度的快速变化非常敏感，盐度超过最佳水平会导致细菌活性降低，迟滞期延长，生长速率和生物质合成速率减慢［72］。另一方面，盐度增加又对菌群生物多样性有所助益。Abed等［70］研究了不同盐度下（2%，4%，7%）石油污染土壤的生物修复效率，实验结果表明，随盐度增加，细菌群落发生显著变化，当盐度从2%变化到4%时，放线菌的丰度急剧增加，在菌群中占统治地位，而放线菌是常见的石油降解微生物，在分解有机物质和利用营养成分上常发挥核心作用［73］。此外，高盐度水平还会降低氧的可用性和石油烃的溶解度，导致石油的生物利用度降低［74］。这是因为高盐度水平时，有机化合物会被强吸附至固体基质上［75］。

2.5 氧气含量

在厌氧条件下，石油污染土壤的生物修复效率低下。氧气供应是否充足是影响生物修复过程的重要因素之一［76］。Hassanshahian等［77］通过生物需氧量（BOD）监测微生物降解有机物时的耗氧量，并指出当氧气供应充足时，菌群的新陈代谢活跃，石油生物降解率较高。Ramsay等［78］采用空压机供氧配合添加营养物质，对澳大利亚Glastone港油污红树林进行现场生物修复，实验结果表明，与未经生物修复处理的油污现场相比，在供氧期间红树林的烷烃降解菌数量增加了1 000倍，芳香烃降解菌数量增加了100倍。

3 结语

在溢油污染海岸线治理技术中，生物修复由于具有高效、环境友好、成本低等优点，被认为是一种极具成本效益的绿色技术。加快石油内在生物修复的途径主要有生物强化和生物刺激两种。为提高石油生物修复效果，并避免在生物强化和生物刺激过程中可能引发的自然生物多样性被破坏、富营养化等环境问题，土著微生物强化（ABA）、固定化微生物技术、可持续释放养分的无机营养替代物和高效生物表面活性剂已成为目前研究的新焦点和趋势所在。

影响生物修复效率的因素复杂多样，尤其在原位/原地进行大规模生物修复试验时，由于存在很多环境因素不可控制的困难，常无法保证实地生物修复的效果。因此，未来的相关实验室研究应充分考虑并模拟溢油污染生物修复治理方案所应用环境的各种现场因素，如石油风化程度、波浪和水流能量、温度、盐度等，且应加强中试规模的试验研究，验证并调整治理方案，以达到科学预测实地石油生物修复过程的目的。

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（编辑 叶晶菁）

Research progresses on bioremediation of oil contaminated shoreline

Meng Juan1，2，Zheng Xilai1，Wang Yuhua2，Sa Zhanyou2
（1.College of Environmental Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao Shandong 266100，China；2.Department of Safety Engineering，Qingdao University of Technology，Qingdao Shandong 266520，China）

The concepts of bioremediation，bioaugmentation and biostimulation are introduced.The research progresses on bioaugmentation and biostimulation of oil contaminated shoreline are summarized，and the advantages and disadvantages of different processing techniques are pointed out.The important factors affecting bioremediation of oil contaminated shoreline are analyzed，such as：oil type，energy of wave and water fl ow，temperature，salinity，oxygen content，etc.The main direction for future research is prospected.

bioremediation；bioaugmentation；biostimulation；oil contaminated soil；shoreline

X55

A

1006-1878（2016）02-0143-08

10.3969/j.issn.1006-1878.2016.02.005

2015-07-10；

2015-12-29。

孟娟（1979—），女，山东省青岛市人，博士生，讲师，电话 13969737449，电邮 juanmoon@163.com。

青岛市黄岛区科技计划项目（2014-1-62）。