郑丽慧，徐 江，李西文，丁晓萍，肖 凌，汪 波，李丹平＊＊

（1.湖北中医药大学 武汉 430065；2.湖北省食品药品监督检验研究院 武汉 430075；3.中国中医科学院中药研究所 北京 100700）

基于ITS2序列鉴定红白二丸药材及其近缘易混品＊

郑丽慧1,2，徐 江3，李西文3，丁晓萍2，肖 凌2，汪 波2，李丹平2＊＊

（1.湖北中医药大学 武汉 430065；2.湖北省食品药品监督检验研究院 武汉 430075；3.中国中医科学院中药研究所 北京 100700）

目的：基于ITS2序列建立红白二丸药材及其近缘易混品的分子鉴定方法。方法：共收集67份红白二丸药材（中华秋海棠）及其近缘易混品（秋海棠、掌裂叶秋海棠和柔毛秋海棠），提取总DNA、PCR扩增ITS2序列并进行双向测序，通过CodonCode Aligner V4.2.1对测序 序列进行质量分析和拼接，采用MEGA 6.0进行多序列比对分析，并基于最近距离法和建树法（NJ树和UPGMA树）对红白二丸药材及其近缘易混品进行物种鉴定。结果：最近距离法和建树法的结果均表明中华秋海棠与其近缘易混品掌裂叶秋海棠、柔毛秋海棠能有效区分，但其与秋海棠未能区分开（秋海棠与中华秋海棠为原亚种与亚种的关系）。结论：ITS2序列可以有效区分红白二丸药材及其近缘易混品的物种基原，可以作为红白二丸药材的分子鉴定方法，为红白二丸药材的真伪鉴别和保证临床用药安全提供有效的技术支持。

DNA条形码 ITS2序列 红白二丸 近缘易混品

秋海棠属药用历史始载于公元1765年的《本草纲目拾遗》，历史悠久，疗效确切，在10多个民族被广泛使用[1]。红白二丸为秋海棠科Begoniaceae植物中华秋海棠Begonia sinensis A.DC.的块茎或全草，又称红黑二丸、岩丸子、鸳鸯七、一点血、山海棠，其性味苦、酸、平，在土家族、苗族、白族、傣族、拉祜族、仡佬族等少数民族常被用来治疗月经不调、跌打损伤和痢疾等症[2-5]。

部分中草药的“同名异物”现象给中草药安全有效使用带来极大的隐患。由于历代本草记载不一致，各地民间的用药习惯不同，以及秋海棠属药材原植物、药用部位形态非常相似等原因，民间常将中华秋海棠与同属植物秋海棠Begonia evansiana Andr.的块茎或全草（秋海棠）、掌裂叶秋海棠Begonia pedatifida Levl.的根状茎（水八角）和柔毛秋海棠Begonia henryi Hemsl.的块茎（岩丸子）都作为红白二丸药材使用[6-9]，但它们的功能主治并不完全相同[10]，造成了红白二丸药材 的误用和混用。目前，秋海棠属药材的鉴定多集中在传统的性状、显微鉴别等方面[11-15]。这些方法的主观性较大、特异性不强，无法满足中草药去伪存真的需求。因此，急需一种快速、稳定的方法来准确鉴别红白二丸药材及其近缘易混品。

DNA条形码技术具有准确、稳定、重现性好、操作简便等特点，是当前物种鉴定的研究 热点[16-21]。目前，中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则已纳入《中国药典》2010年版第三增补本附录及《中国药典》2015年版指导原则[22，23]，已在多种动植物药材及其混伪品的鉴定中得到了广泛的应用［23-30］。本研究利用ITS2序列对红白二丸药材及其近缘易混品进行DNA条形码鉴定研究，可为红白二丸药材的快速、准确鉴定及其安全用药提供技术保障和科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验共收集了红白二丸药材（中华秋海棠B. sinensis的块茎、全草）及其近缘易混品（秋海棠B. evansiana的块茎、全草，掌裂叶秋海棠B. pedatifida的根状茎，柔毛秋海棠B. henryi的块茎）共4个物种67份样品，以上样品均经中南民族大学万定荣教授鉴定，样品信息详见表 1。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

取干燥药材经75%乙醇擦拭药材表面后称取50 mg（原植物干燥叶片称取30-40 mg），高通量组织球磨仪研磨2 min（50 Hz），利用植物DNA提取试剂盒（批号：03428，北京天根生化科技有限公司公司）提取总DNA，叶片样品65℃水浴30 min，块茎样品加核分离液（100 mmol·L-1，Tris-HCL，pH=8.0；20 mmol·L-1EDTA，pH=8.0；0.7 mmol·L-1，NaCl，2% PVP40，0.4% β-巯基乙醇）[31]洗涤，每次800 μL，洗涤3次后，65℃水浴3 h，其余步骤按照试剂盒说明进行。

1.2.2 PCR扩增及测序

ITS2序列扩增及测序的通用引物ITS2F为：5′-ATGCGATACTTGGT GTGAAT-3′，ITS3R为：5′-GA CGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。PCR反应体积为25 μL，体系内含2×Tag PCRMaster Mix（批号：261742AX，北京艾德莱生物科技有限公司）12.5 μL、引物各1.0 μL（2.5 μmol·L-1）、模板DNA为2 μL，加灭菌双蒸水至25 μL。扩增程序：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，40个循环，72℃延伸10min[32]。PCR扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳进行检测，将条带单一且清晰的PCR产物用全自动DNA测序仪（型号：2720XL，美国Applied Biosystems公司）进行双向测序。

1.2.3 数据处理

将测序后的序列使用CodonCode Aligner V4.2.4（美国CodonCode公司）校对拼接，去除引物区，同时基于隐马尔可夫模型HMMer注释除去5.8S 和28S，从而获得ITS2序列[34]。所有序列用软件 MEGA 6.0（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）进行比对分析[35]，并基于Kimura 2 Paramete（K2P）双参数模型计算种内、种间遗传距离分析，用邻接（Neighbor Joining，NJ）法、（UPGMA）构建系统发育树，利用Bootstrap（1 000次）检验各分支的支持率。

表1 红白二丸药材及其近缘易混品

2 结果与分析

2.1 红白二丸药材及其近缘易混品序列变异分析

红白二丸药材及其近缘易混品的序列长度在226-310 bp，其ITS2序列特征及遗传距离见表2。

中华秋海棠（B. sinensis）的ITS2序列共22条，序列平均长度309 bp，平均GC含量为60.2%，有12个变异位点，9个单倍型，A2和A6是中华秋海棠主要的单倍型。红白二丸药材ITS2序列种内变异位点见表3。

表2 红白二丸及其近缘易混品的ITS2序列特征及遗传距离

表3 红白二丸药材ITS2序列种内变异位点

秋海棠（B. evansiana）ITS2序列共14条，序列平均长度308 bp，平均GC含量为60.1%，有3个变异位点，分别是197位点C-T变异、265位点T-C 或T-Y变异、289位点G-A变异，5个单倍型。

掌裂叶秋海棠（B. pedatifida）ITS2序列共21条，序列平均长度310 bp，平均GC含量为58.6%，有5个变异位点，分别是18位点C-T变异，45位点T-A变异，47位点、93位点C-G变异，120位点G-A变异，6个单倍型。

柔毛秋海棠（B. henryi）ITS2序列共10条，序列平均长度246 bp，平均GC含量为61.4% ，有9个变异位点，分别是19位点A-G变异、194位点A-T变异、201位点G-T变异，210位点、213位点G-C变异，217位点、219位点A-C变异，221位点T-G变异，230位点G-A变异，5个单倍型。

2.2 红白二丸药材及其近缘易混品遗传距离分析

基于ITS2序列的K2P遗传距离分析结果表明，中华秋海棠的最大种内距离为0.040 3；在中华秋海棠与3种近缘易混品的种间最小遗传距离中，中华秋海棠与柔毛秋海棠的距离最远，为0.144 6；其次是中华秋海棠与掌裂叶秋海棠，为0.095 6；中华秋海棠与秋海棠的最近，为0.000 0。红白二丸药材及其近缘易混品的种内种间K2P遗传距离见表2。红白二丸药材的种内K2P遗传距离及其与各近缘易混品的种间K2P遗传距离见表4。

2.3 红白二丸药材及其近缘易混品ITS2序列聚类分析

基于ITS2序列构建红白二丸药材及其近缘易混品UPGMA树（图1）和NJ树（图2），2种方法均采用K2P距离，并以Bootstrap作1 000次可信度分析，以评价分支的统计学意义和可靠性。由图1所示结果可以看出，柔毛秋海棠10个样本聚为一支，其单系分支支持率为100%；掌裂叶秋海棠21个样本聚为一支，其单系分支支持率为100%；中华秋海棠与秋海棠聚为一大支。同时，NJ树得到的结果与UPGMA树得到的结果类似，掌裂叶秋海棠和柔毛秋海棠均单独聚为一支，秋海棠和中华秋海棠聚为一大支。

表4 红白二丸种内K2P遗传距离及其与各近缘易混品的种间K2P遗传距离

图1 基于ITS2序列构建红白二丸药材及其近缘易混品UPGMA树

3 讨论

3.1 DNA提取与PCR扩增

本实验采用的是植物DNA试剂盒提取法提取67份样品总DNA，提取效率高、方便。通过实验发现：第一次PCR体系中模板DNA的量是2 μL，PCR成功率为50%，然后将第一次PCR失败的样品DNA进行浓度测定，发现浓度偏高，其中最高的3个样品浓度达到了1 410 ng·μL-1、911 ng·μL-1和835 ng·μL-1。于是将PCR失败样品的DNA模板量改为1 μL，水相应的增加1 μL，重新PCR，结果电泳检测条带单一清晰，PCR成功率达到了100%。这表明PCR体系中模板DNA浓度过高会导致PCR扩增失败。因此，合适的模板DNA浓度是保证PCR扩增成功的重要因素之一。

3.2 红白二丸药材及其近缘易混品的鉴定

基于ITS2序列的K2P遗传距离分析结果表明，不同产地的22份中华秋海棠的种内最大遗传距离为0.040 3，中华秋海棠与其近缘易混品掌裂叶秋海棠、柔毛秋海棠、秋海棠间的最小种间遗传距离为分别为0.095 6、0.144 2、0.000 0。除秋海棠外，中华秋海棠与掌裂叶秋海棠、柔毛秋海棠的最小种间遗传距离均远远大于中华秋海棠的种内最大遗传距离，这表明中华秋海棠与其近缘易混品掌裂叶秋海棠、柔毛秋海棠被很好的区分；而中华秋海棠与秋海棠则不能被有效区分。

图2 基于ITS2序列构建红白二丸药材及其近缘易混品NJ树

基于UPGMA法构建的系统发育树（UPGMA树）是在假设一棵进化树中所有物种的进化速率是相同的的情况下构建的系统发育树，结果发现掌裂叶秋海棠和柔毛秋海棠均单独分为一支，表现出良好的单系性，而秋海棠和中华秋海棠都聚在一支；而NJ树不用假设进化树中所有物种的进化速率相同，其得到的结果与UPGMA树的结果相似，支持了UPGMA树的结果。

通过分析序列变异位点、遗传距离和系统发育树的结果均表明：中华秋海棠与其近缘易混品掌裂叶秋海棠、柔毛秋海棠能很好的区分；而中华秋海棠和秋海棠不能有效区分。《全国中草药汇编》将秋海棠和中华秋海棠定为两种不同的药材，而《中国植物志》和Flora Of China将秋海棠和中华秋海棠分别处理为原亚种B. grandis subsp. grandis与亚种 B. grandis subsp. sinensis （A. D.C.） Irmsch.[36，37]。根据《中国植物志》和Flora Of China分类标准，在实践中即使是对一株具备全部重要性状的个体开展鉴定，也无法对秋海棠的种下单元进行准确分类。在考察全国各地馆藏标本时也发现该种的鉴定十分混乱，同一地区、同一地点、甚至同号的标本往往被鉴定为不同亚种[38]。所以本文希望以形态学为基础，结合分子生物学手段提出新的种下分类处理及标准。考虑到ITS2是一种用于区分物种间的DNA条形码，针对秋海棠和中华秋海棠的特异性分子标记仍需要开发。

4 结论

本实验对6个不同产地的67份红白二丸药材及其近缘易混品进行DNA条形码研究，基于ITS2序列的变异位点、最近距离法、系统发育树（NJ树和UPGMA树）分析结果均能够很好地将红白二丸药材与其近缘易混品掌裂叶秋海棠、柔毛秋海棠有效区分，中华秋海棠和秋海棠不能有效区分。因此，ITS2序列在物种水平上可以准确鉴定红白二丸药材及其近缘易混品，证明ITS2条形码技术在物种水平上对中草药具有良好的鉴定能力。该研究为红白二丸药材的真伪鉴别和安全有效用药提供技术支持。

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Identification of Hongbaierwan (Begonia Sinensis) and Its Relative Adulterants Based on ITS2 Sequence

Zheng Lihui1,2, Xu Jiang3, Li Xiwen3, Ding Xiaoping2, Xiao Ling2, Wang Bo2, Li Danping2
(1.College of Pharmacy, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065, China; 2. Hubei Institute for Food and Drug Control, Wuhan 430075, China; 3. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China)

This study aimed to establish a molecular identification method for Hongbaierwan (B. sinensis) and its relative adulterants based on ITS2 sequence. The genomic DNAs from sixty seven samples were extracted, and the ITS2 sequences were amplified and bi-directionally sequenced. All sequences were assembled and obtained by CodonCode Aligner V4.2.4. The intra-specific and inter-specific genetic distances were computed and the phylogenetic trees (NJ tree and UPGMA tree) were constructed by MEGA 6.0 based on the Kimura 2-Parameter (K-2P) model. It was found that the maximum intra-specific genetic distance within B. sinensis was lower than the minimum inter- specific distances between B. sinensis and its relative adulterants (B. pedatifida and B. henryi), while the distance was higher than the minimum inter-specific distance between B. sinensis and B. evansiana. The NJ tree and UPGMA tree showed that B. sinensis could be distinguished from B. pedatifida and B. henryi，however, B. sinensis and B. evansiana could not be distinguished. It was concluded that ITS2 sequence could discriminate B. sinensis from its relative adulterants at species level effectively as a molecular identification method of Hongbaierwan and its relative adulterants, which provided a support for safety clinical use of Hongbaierwan.

DNA barcoding, ITS2 sequence, Hongbaierwan, relative adulterants

10.11842/wst.2016.02.014

R282.5

A

（责任编辑：马雅静 张志华，责任译审：朱黎婷 王 晶）

2015-11-29

修回日期：2015-12-07

＊ 湖北省自然科学基金委重点项目（2015CFA098）：湖北常用秋海棠科药用植物DNA条形码鉴定及亲缘关系分析，负责人：李丹平。

＊＊ 通讯作者：李丹平，主任药师，硕士生导师，主要研究方向：中药资源及其品质研究。