施少军　薛　峰

上海交通大学医学院附属仁济医院肝脏外科(200127)



消化系统肿瘤外周血循环肿瘤细胞的研究进展

施少军薛峰*

上海交通大学医学院附属仁济医院肝脏外科(200127)

摘要近年来，外周血循环肿瘤细胞(CTCs)检测已作为一项“液相活检”技术应用于临床实践。CTCs的肿瘤自我播种机制为探索恶性肿瘤的生长机制以及开发相应的肿瘤靶向治疗提供了新思路。10年前美国食品与药品管理局(FDA)即已批准将计数分析CTCs的CellSearch系统应用于临床监控乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌根治术后肿瘤复发。尽管近年来CTCs分离和检测技术得到了显著提升，然而在消化系统肿瘤领域，检测CTCs的临床意义尚在研究中。本文就消化系统肿瘤外周血CTCs的研究进展作一综述。

关键词肿瘤细胞，循环；消化系统肿瘤；肿瘤转移；预后

Research Progress of Peripheral Blood Circulating Tumor Cells in Digestive System Tumors

SHIShaojun,XUEFeng.DepartmentofHepaticSurgery,RenJiHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai(200127)

Correspondence to: XUE Feng, Email: fengxue6879@163.com

AbstractRecently, the detection of circulating tumor cells (CTCs) in peripheral blood is used in clinical practice as a form of ‘liquid biopsy’. The self-seeding mechanism of CTCs provides a novel approach to explore the growing mechanism of malignant tumor and developing corresponding targeting therapies. A decade ago, the CellSearch system, which can capture and enumerate CTCs, has been validated by Food and Drug Administration (FDA) as an aid for monitoring the relapse of tumor after radical operation in patients with breast, prostate and colorectal cancer. In recent years, although the separation and detection technique of CTCs has been promoted significantly, the clinical significance of CTCs in tumors of digestive system is still under investigation. This article reviewed the research progress of peripheral blood CTCs in digestive system tumors.

Key wordsNeoplastic Cells, Circulating;Digestive System Neoplasms;Neoplasm Metastasis;Prognosis

循环肿瘤细胞(CTCs)是指自发或因诊疗操作从肿瘤原发灶或转移灶脱落进入外周血液的肿瘤细胞。10年前美国食品与药品管理局(FDA)即已批准将计数分析CTCs的CellSearch系统应用于临床监控乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌根治术后肿瘤复发[1]。CTCs与肿瘤转移、复发相关性的研究在近年亦取得较大进展。同时，CTCs检测具有无创、方便、可重复等特点，可作为一种“液相活检”技术应用于临床实践。然而在消化系统肿瘤领域，检测CTCs的临床意义尚在研究中。本文就消化系统肿瘤外周血CTCs的研究进展作一综述。

研究表明，外周血CTCs在肿瘤发生阶段发挥重要作用。Kim等[2]的研究显示，CTCs不仅可脱离原发肿瘤灶转移至其他器官，同时亦能重新返回并逆向渗透进原发瘤灶，促进肿瘤增殖和生长，增强原发瘤灶的侵袭性，此过程称为肿瘤自我播种(tumor self-seeding)。该过程为探索恶性肿瘤的生长机制以及开发相应的肿瘤靶向治疗提供了新思路。

继发性肿瘤转移主要包括CTCs脱落入血以及CTCs对远隔器官环境再适应两个过程。不同来源的CTCs转移潜能有所不同。外周血CTCs既可能是直接从病灶脱落入血的上皮特征CTCs，亦可能是经历上皮-间质转化(EMT)脱落并存活于血液中的CTCs[3]。研究表明，发生EMT的乳腺癌细胞不仅获得了自我更新能力，同时亦具备一定的抗凋亡能力[4]，此可能是肿瘤患者对化学疗法产生耐药性的原因之一[5]。

CTCs分离和检测技术在近年得到了显著提升。CTCs在外周血中非常稀少，因此检测前需先进行CTCs 富集。富集方法基于CTCs的物理性质或免疫磁性，目前磁激活细胞分选(MACS)是最常用的技术手段[6]。而对于富集后的CTCs检测，目前RT-PCR及其改进技术的应用最为广泛，诸多研究者已成功将其应用于恶性黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、胃癌以及结直肠癌(CRC)等肿瘤的检测[7]。

一、食管癌

食管癌是发生在食管上皮组织的恶性肿瘤，90%以上为食管鳞状细胞癌。目前活组织病理学检查以及影像学检查是食管癌最重要的诊断和分期手段。但采集组织学标本创伤大，患者依从性差；影像学检查难以测及微小肿瘤病灶。近年来有学者提出将外周血CTCs作为诊断食管癌分期以及监控转移、复发的血清学指标[8]。在食管癌CTCs检测方面，多数研究者选择癌胚抗原(CEA)作为CTCs的靶基因，其敏感性和特异性较高。Tanaka等[9]提出，将鳞状细胞癌抗原(SCCA)作为CTCs的检测靶点，与CEA比较后发现两者敏感性和特异性无显著差异。

近年来，关于食管癌CTCs临床应用的研究多集中于围手术期预后判断和监控方面。Liu等[10]应用CEA特异性RT-PCR技术，对53例食管癌患者术前(B-1)、 术后即时(B 0)以及术后3 d(B+3)的外周血进行CTCs检测，结果显示B-1与B 0以及B+3的CEA阳性率均具有显著差异。该研究还认为食管癌根治术是引起肿瘤细胞脱落入血以及外周血CTCs数量升高的重要原因，并可能与食管癌微转移相关。有学者认为食管癌CTCs可能是来源于已发生转移的淋巴结或其他远处微小转移灶[11]，但尚无确切证据支持此推测，需进一步研究证实。

CTCs检测对食管癌放化疗的疗效监测亦有一定临床价值。Yin等[12]对72 例食管鳞状细胞癌患者放疗前后的外周血CTCs进行检测，结果显示放疗前后CTCs 阳性率与淋巴结转移以及两年无进展生存期相关，且CTCs 阳性率可反映患者对放疗的敏感性，为治疗方案的选择提供重要依据。

二、胃癌

胃癌起病隐匿，多数患者在确诊时已进展至晚期阶段。目前胃癌诊断主要依据临床表现、肿瘤标记物、影像学以及组织活检等手段，早期诊断效果不尽人意。近年有学者提出将外周血CTCs检测作为诊断早期胃癌的辅助方法[13]，但其有效性尚存争议。Tang等[14]对国内外20项相关研究行meta分析后认为，尽管CTCs阳性在确认既存胃癌方面有优势，但其阴性结果不能作为排除胃癌诊断的有力指标，也不能作为胃癌的筛选检查指标。

RT-PCR是目前检测胃癌CTCs最常用的技术，但关于CTCs标记物的选择仍存在诸多争议。近年研究以CK-19、CK-20、CEA和hTERT四种标记物居多，这四种标记物检测的准确性无显著差异，多种标记物联合检测可提高敏感性和特异性[15]。此外，原癌基因c-Met和黏蛋白(MUC)亦可作为CTCs检测的标记物。Uen等[16]证实c-Met和MUC1特异性RT-PCR技术在监控胃癌早期微转移方面是一项有潜力的技术。

胃癌CTCs检测对治疗方案的指导意义成为近年来的研究热点。Miyazono等[17]在胃癌根治术术前和术后对57例胃癌患者外周血进行CTCs跟踪检测，结果显示CTCs阳性患者即使实施胃癌根治术，其复发率仍较高。研究者认为手术操作是导致癌细胞进入血循环的直接原因。该研究建议，在行胃癌根治术时，阻断被肿瘤侵染的胃壁血流，夹闭大血管如胃左右动脉，并在术后积极化疗，可有效预防血源性转移。

三、肝细胞癌(HCC)

HCC是我国常见的恶性肿瘤之一，侵袭、转移能力强，早期即可侵犯血管甚至远处转移。目前常用的HCC早期筛查手段包括甲胎蛋白(AFP)和超声检查，但AFP的敏感性和特异性均较低；B超过于依赖操作者的个人判断，且对肥胖或肝硬化患者的诊断效果不佳[18]。有研究将外周血CTCs检测作为HCC诊断、分期以及监测预后的辅助手段，以弥补AFP和超声诊断的不足。Sun等[19]的研究表明，肝切除术前CTCs数量≥2个/7.5 mL是HCC复发的独立危险因素，尤其对于AFP≤400 ng/mL的患者，CTCs数量对预后更加重要。

近年来关于上皮细胞黏附分子(EpCAM)(+)CTCs与HCC的关系存在争议。EpCAM(+)CTCs具有干细胞样特性，如CD133和ABCG2的表达、EMT过程、Wnt通路激活、高致癌潜能以及低凋亡倾向。此类CTCs具有更强的侵袭性，可能与HCC微转移有关，患者预后往往不佳[19-21]。然而，Yamashita等[22]的研究根据CTCs是否表达EpCAM以及患者AFP水平，将CTCs分成四个亚型，分别为EpCAM(+)AFP(-)(A型)，EpCAM(+)AFP(+)(B型)，EpCAM(-)AFP(+)(C型)，EpCAM(-)AFP(-)(D型)。研究者发现，就预后而言，B型和C型较差，D型居中，A型较好。该研究同时证实Wnt通路在预后较差的B组更易被激活。由此可见，EpCAM(+)CTCs在预后评估方面的临床应用仍有待研究，但此种联合分型系统不失为一种有前景的预后评估方法。

尽管目前肝移植技术发展日益成熟，但对HCC患者是否适合接受肝移植仍有分歧，最突出的争议之一为移植后肿瘤的复发和转移。结合外周血CTCs检测技术，Toso等[23]提出肝癌肝移植术后复发预防五步策略：①选择外周血CTCs基线水平低的受者；②减少术中释放入血的CTCs数量；③防止CTCs的肝内再植；④使用抗肿瘤药物；⑤调节针对HCC清除的免疫反应。该方案具体的临床效果仍有待进一步研究和验证。

四、胰腺癌

胰腺癌是一种侵袭力强的恶性肿瘤，晚期或转移性胰腺癌患者的中位生存期不甚理想。目前传统的血清学指标和影像学手段在指导治疗方案选择、监测治疗效果以及判断复发转移等方面存在缺陷。近年来胰腺癌CTCs的相关研究为解决上述问题提供了新思路。

Torphy等[24]将胰腺导管腺癌(PDAC)患者的癌细胞移植至NSG/NOD小鼠，形成胰腺癌异种移植(PDX)小鼠模型，并给予一种新型靶向药物BKM120(磷脂酰肌醇3激酶抑制剂)或赋型剂治疗，结果显示BKM120组小鼠血液中CTCs数量较赋型剂组明显减少，进一步对分离出的CTCs行基因突变测序，发现CTCs均有KRAS G12V突变，与原发肿瘤灶相吻合。由此可见，CTCs突变分析以及对CTCs数量持续监测，可以作为评估PDAC化疗效果的手段。

局部进展期胰腺癌(LAPC)患者由于确诊时肿瘤已局部扩散至主要动脉(腹主动脉和肠系膜上动脉)，因此肿瘤无法彻底切除，但尚无远处转移的征象。目前此类型胰腺癌患者的治疗策略颇具争议，焦点主要集中于全身系统性化疗以及局部放疗的选择。Bidard等[25]通过一项多中心随机对照试验，对LAPC患者接受化疗前后的血液CTCs进行检测，发现CTCs阳性是LAPC患者总生存率的一项独立预后因素，提示对于LAPC患者，CTCs检测可作为评估LAPC预后的指标。

五、CRC

CRC是世界第三大常见恶性肿瘤，目前多使用CEA作为CRC肿瘤指标，但对于CRC 转移(mCRC)的患者，CEA的有效性颇具争议[26-27]。有研究者建议对于mCRC患者可采用CTCs检测取代CEA筛查。Aggarwal等[27]在一项多中心前瞻性研究中，对217例mCRC患者在接受化疗前以及化疗20周后的外周血CTCs数量和CEA水平进行持续性监测，结果显示在化疗进行6~12周时，相较于CEA，CTCs≥3个/7.5 mL预测患者总生存期的有效性更为稳定。

研究[28]显示，部分mCRC患者对化疗的耐药性可能与KRAS、BRAF基因突变有关。该研究对mCRC患者外周血CTCs测序后发现，CTCs的KRAS和BRAF基因突变率与原发灶以及转移灶基本符合，提示通过外周血CTCs单细胞基因测序可预测化疗疗效，指导个体化治疗。

细胞角蛋白(cytokeratin, CK)、EpCAM是目前CRC常用的CTCs标记物。EMT是CRC远处转移的重要环节，但该过程会导致CK、EpCAM表达下降，从而影响CTCs的检测和捕获率[29]。Yokobori等[30]的研究发现，CTCs标记物网质3(plastin3, PLS3)在mCRC细胞中的表达不受EMT过程影响，可有效代替CK和EpCAM用于CTCs的检测。Lyberopoulou等[31]的研究显示，PLS3检测有助于新型无创诊断技术的发展，同时也扩大了针对癌症患者进行个体化治疗的规模。

六、结语

CTCs检测的优势在于安全、无创，可在疾病进展的任意时间点进行疗效监测和病情评估。根据现有研究，我们对CTCs可能的临床应用方向作出以下总结：①评估和预测患者肿瘤进展以及复发、转移；②患者的分层、分级管理以及实时跟踪治疗效果；③探索治疗靶点和抗肿瘤药物耐受机制；④明确肿瘤患者的复发转移机制。CTCs作为早期癌症的筛选指标尚缺乏有力证据，可能与早期癌症无转移灶或CTCs入血量少有关。

此外，对于消化系统肿瘤CTCs，单细胞分析技术已成为一种热门的研究手段。通过基因测序有助于探索肿瘤转移机制，甚至有望找到更多有效的治疗靶点，耐药性基因的定位亦能够有效地指导临床医师进行抗肿瘤治疗。此外，消化系统肿瘤异质性明显，检测CTCs时需选择特定的CTCs标记物，目前常用的标记物尚不能满足对检测准确度的要求，因此有待寻找新的标记物或联合使用多种标记物以提高CTCs的检出率和准确性。

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(2015-05-02收稿；2015-05-16修回)

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2016.02.011

*本文通信作者, Email: fengxue6879@163.com