潘严

[摘要] 目的 探讨Beagle犬骨髓像各个细胞系正常值的参数范围及其细胞形态学特征，并和正常成人的骨髓像进行了比较，为了给新药临床前研究中受试物作用的靶器官是造血系统的临床前药物安全评价研究实验提供诊断依据。 方法 对30只实验对照用Beagle犬（雌雄各半）和正常成人的骨髓涂片用瑞-姬氏混合染色液染色后进行形态学观察，油镜下，分类计数粒细胞系统，红细胞系统，淋巴细胞系统，单核细胞系统，浆细胞系统及其他细胞，总计500个有核细胞，以百分率表示。高倍镜下计数全片巨核细胞数并计算其粒红比值。用SPSS19.0进行配对比较，计算t值和P值。 结果 Beagle犬正常骨髓像中骨髓细胞名称，骨髓增生变化的分级，骨髓细胞各系统、各阶段的细胞形态学的划分基本是参见人的骨髓细胞学分类标准进行，Beagle犬和正常成人在粒细胞系统，红细胞系统，巨核细胞系统等六大系统细胞存在显著性差异（P<0.01或<0.05）。正常情况下，Beagle犬同系同阶段的骨髓细胞胞体均比人的略小，犬粒细胞系统可见环核，核染色质比人粗糙，胞质量没有人的粒细胞胞质丰富；Beagle犬成熟淋巴细胞一般<10%，正常成人成熟淋巴细胞20%～30%；Beagle犬骨髓像中颗粒型巨核细胞明显比人多，并常见破骨细胞。Beagle犬的粒红比可简记为2～2.2倍。人的粒红比值2～4倍。 结论 Beagle犬和正常成人在骨髓有核细胞增生程度，有核细胞（粒系，红系，巨核系），淋巴细胞，非造血细胞的数量和形态学特征等方面存在显著差异。通过犬和正常成人骨髓像的比较，给深入研究药物对造血系统的改变提供了参考数值。

[关键词] Beagle犬；正常成人；粒红比值；骨髓像

[中图分类号] R329 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2016）01-21-05

[Abstract] Objective To investigate the parameter range of the normal value and morphological features of bone marrow cells between Beagle dog and normal adult， and provide a diagnostic basis for the research that the target organs of test samples function in the preclinical study of new medicines is the safety evaluation research experiment of the pre-clinical medicines of hematopoietic system. Methods 30 experimental control Beagle dogs （half male and half female） and normal adults' bone marrow smear were Rui-Ji mixed staining fluid， and morphologically observed. Under the oil microscopy， there were a total 500 nucleated cells， such as differential counting granulocyte system， erythrocyte system， lymphocyte system， monocyte system， plasmocyte system and other cells， which was expressed with a percentage. Under a high power microscopy， the number of megakaryocytes and calculate their myeloid erythroid ratio were counted. Made a pair comparison with SPSS19.0 and compute t value and P value. Results Name of bone marrow cells in normal marrow picture of Beagle dogs， the classification of the change of bone marrow hyperplasia， and the classification of cell morphology of each system and phase of bone marrow cells basically referenced the classification standards of the human's bone marrow cells. P value of granulocyte system， erythrocyte system， megakaryocyte system and so on six big systems cells of Beagle dogs and normal adults was less than 0.01 or less than 0.0005， so there were significant differences. Under normal circumstances， the cell body of the bone marrow cells of homologous Beagle dog in the same phase was slightly smaller than people's， dogs' granulocyte system had a visible core-annulus， and their nuclear chromatin was rougher than people's， and their quality of cells was less rich than peoples' granulocytes； The mature lymphocytes of Beagle dog was usually less than 10%， and the mature lymphocytes of normal adults was between 20% and 30%； The number of granular megakaryocytes in born marrow picture of Beagle dogs was obviously larger than that of people， and there were usually osteoclasts. The myeloid erythroid ratio of Beagle dog could be counted as 2 to 2.2 times and people's myeloid erythroid ratio was 2 to 4 times. Conclusion There are differences in terms of the hyperplasia degree of bone marrow nucleated cells， the number and morphological features of nucleated cells （granulocytes， erythrocytes， megakaryocytes）， lymphocytes， non-hematopoietic cells of Beagle dogs and normal adults. Through the comparison of bone marrow picture of dogs and normal adults， it provides referential data for an in-depth research that the medicines change the hematopoietic system.

[Key words] Beagle dog； Normal adult； Myeloid erythroid ratio； Born marrow group

从1993年以来的新药非临床研究技术指导原则，对新药（诸如一些化学合成药、生物制剂、中药）的长期毒性试验研究中，均要求进行骨髓细胞学检查[1]。2005年二月版中药天然药物长期毒性研究技术指导原则中又明确指出当受试物可能对造血系统有影响时，应进一步进行骨髓检查[2]。在药物重复给药毒性试验技术指导原则中也反复强调了重复给药毒性试验通常需要制备骨髓涂片，以便当受试物可能对动物造血系统有影响时进行骨髓检查。技术指导原则重申进行骨髓检查，体现了骨髓检查在药物重复给药试验中的重要性。抗肿瘤药物临床前毒性研究中也涉及到根据细胞毒类药物毒性或潜在毒性的情况，按一定比例增加剂量，建立这种比例可接受的终点，包括骨髓抑制等严重毒性的直接测定。由于造血系统常常会受到药物的影响，所以骨髓涂片评价也是在药物安全性评价中评估药物对造血系统影响的一个重要的组成部分[3]。刘芳，范玉明等提出了骨髓造血及血液毒理学这一新兴的学科概念[4]。李建祥等着重论述了血液毒理学的研究方法包括骨髓的毒性研究[5]。因此研究骨髓像显得尤为重要。目前关于Beagle犬正常骨髓像的形态学特点和描述及参考数据较少，建立起相关的参考数据，给深入研究骨髓毒性，以及犬等动物的异常细胞学形态提供客观的数据支持。

1 材料与方法

1.1 一般材料

本研究收集了北京玛斯生物技术有有限公司提供的30只Beagle犬（5～6个月龄，雌雄各半）。采用1.5%戊巴比妥静脉注射进行麻醉，每公斤注射2mL或3mL麻醉放血后，采集第6或第7肋骨，用涂片法制作骨髓涂片。正常成人采用髂骨前上棘穿刺，涂骨髓片与涂血片方法基本一致[6]。

1.2 方法

等骨髓涂片自然晾干或于37℃温相中促干后，使用珠海贝索生物技术公司出品的瑞氏-姬姆萨混合染色液对骨髓涂片进行染色，一般环境温度在15～28℃，染色时间为30～40min。当温度低或高时，可适当分别延长和缩短染色时间。油浸镜下分类计数500个有核细胞，以百分率表示。高倍镜下计数全片巨核细胞数，血小板计数25个（成熟有血小板形成和成熟无血小板形成）[7]。

1.3 统计学方法

通过Excel2010版把骨髓细胞各个系统的分类计数值汇总成平均值及标准差，再根据每类骨髓细胞的平均值及标准差用SPSS19.0统计软件进行两组独立样本的t检验，计算t值和P值[8]（详见表1～2），以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Beagle犬和人骨髓有核细胞分类计数值

根据人骨髓有核细胞增生程度的标准划分，犬的骨髓像增生程度是增生明显活跃。参见有核细胞分类计数方法计数500只有核细胞后进行分类汇总，两者再加以比较。

从表1，2，可以很清楚地看出Beagle犬和正常成人在粒细胞系统，红细胞系统，淋巴细胞系统，单核细胞系统，浆细胞系统和巨核细胞系统六大系统的细胞，两者之间存在显著性差异（P<0.01，P<0.05）。

2.2 犬骨髓细胞形态学特征

2.2.1 粒细胞系统 以成熟阶段细胞为主，原幼粒细胞胞体比成熟阶段细胞稍大，胞核多呈圆形或椭圆形，核染色质较细致呈沙粒状，分布较均匀，有3～5个淡蓝色核仁，胞浆量少。中性杆状核粒细胞更多见，相对中性分叶核粒细胞就少一些。嗜酸性粒细胞有时较多见。并且犬的核染色质比人的略粗糙，排列不整齐，着色也不够均匀。尚有部分细胞的核染色质出现聚集，胞质量也不如人的丰富[10]。

2.2.2 红细胞系统 以中晚幼红细胞为主。原、早幼红细胞的胞核圆形或椭圆形，位于中央或稍偏位，核染色质呈粒状，有聚集趋势。原始红细胞的胞质比原粒细胞的胞质着色更深。犬的中晚幼红细胞胞体较小，胞质少，边缘不整齐。

2.2.3 巨核细胞系统 幼巨核细胞的核染色质呈颗粒状，胞质量多，有细小的嗜天青颗粒。颗粒巨核不规则核染色质粗糙，胞质丰富，含有大量的紫红色颗粒[11]。Beagle犬的巨核细胞要注意与破骨细胞加以鉴别，两者最主要的不同点是胞核。而犬成熟型的巨核细胞胞体比破骨细胞略小，胞核巨大不规则或分叶，看不见核仁。细胞周围可附有血小板，有时可见血小板正在脱出。

2.2.4 淋巴细胞系统 犬的成熟淋巴细胞占有核细胞的比例约<10%左右。细胞特点核偏位，在核一侧有少量胞浆，且着色呈半透明状。

2.2.5 其他细胞 犬的正常骨髓像中成骨细胞比较常见。Beagle犬成骨细胞胞体较大，多为长椭圆形或不规则形，常多个成簇分布，有时单个存在。胞核椭圆形或圆形，常偏于一侧，核染色质呈粗网状排列，胞质丰富，淡蓝色，常有空泡，离核较远处常有椭圆形淡染区偶见少量紫红色颗粒，胞质边缘模糊呈云雾状。成骨细胞又称为造骨细胞，与浆细胞有许多相似之处，而且有时单个存在，两者应注意鉴别。

2.3 正常成人骨髓像

正常情况下，人同系同阶段的骨髓细胞均比Beagle犬的略大。粒系数目约40%～60%成熟粒细胞中杆状核多于分叶核分化、形态正常。红系数目约20%，以中晚幼红细胞为主平均各约10%。巨核系整张骨髓片可见巨核细胞7～35个，难见原始巨核细胞。产板型巨核细胞占50%～60%，髓片约每25个成熟红细胞应有一个血小板，不能出现异形和巨大血小板。淋巴细胞约20%，难见到原始淋巴和幼稚淋巴细胞。单核细胞主要是成熟阶段数目小于4%，浆细胞主要是成熟阶段数目小于2%。骨髓片中可以见到少量非造血细胞，如网状细胞，吞噬细胞，组织嗜酸细胞等。无异常细胞和寄生虫，不易见核分裂象。骨髓有核细胞增生活跃。粒红比正常2～4∶1，粒红比人可简记为2～4倍[12]。

2.4 Beagle犬与正常成人骨髓像的差异

Beagle犬有核细胞增生程度是依据人骨髓有核细胞增生程度的标准来定可判断为增生明显活跃，雄性犬粒红比值为（1.48±0.32），雌性犬粒红比值为（1.23±0.24）。此结果与吉兰姣，塔娜等[13]测的Beagle犬正常骨髓粒红比值的结果比较一致（1.25±0.41）。为了便于记忆，犬的粒红比值可简化为2～2.2倍。正常成人粒红比值可以简记为2～4倍。犬的中晚幼粒细胞胞核可呈环形核[10]，正常成人没有。犬的中晚幼红细胞胞浆不如人的丰富，核染色质较人粗糙。淋巴细胞数量比人少，有时能见到异形淋巴细胞2型容易和单核细胞混淆注意鉴别。Beagle犬正常骨髓像中破骨细胞和成骨细胞比较多见，正常成人偶见。以上Beagle犬形态学特征和乔建维，李志荣等狗、大白鼠正常骨髓像观察[14]一文中所述的犬的细胞形态观察结果较一致。

3 讨论

根据本次研究得出的数据表明Beagle犬与正常成人在骨髓细胞六大主要系统中细胞形态学特征存在不同点，细胞计数值也存在着显著性差异。依据人的骨髓有核细胞增生程度五级估计，犬的有核细胞与成熟红细胞的比例是高于正常成人的，这可能与骨穿的部位和方法有密切的关系。目前长期毒性试验非啮齿类实验动物一般选择犬的股骨作为穿刺部位，穿刺时应当注意骨髓穿刺针垂直刺入皮肤肌肉，抵达股骨转子窝的位置后再左右旋转进入骨髓腔，当到达骨髓腔时有落空或疏松感视为已进入骨髓腔，注射器针筒部分可见骨髓液时才能算抽吸完毕[2]。正常成人骨髓穿刺术的方法主要有胸骨穿刺术，髂骨前（后）上棘穿刺术脊突穿刺术和胫骨前穿刺术五种[15]。临床上穿刺术的选择依据患者病史、症状、体征而定，必要时行多部位穿刺以便能全面了解骨髓情况。每张骨髓涂片最好都含有骨髓小粒，这是骨髓液的特征，以便与血液相鉴别。Beagle犬骨髓涂片时需用种属动物血清稀释，注意涂片的厚薄程度，以便全片计数巨核细胞并注意与破骨细胞加以鉴别，两者最主要的不同点是胞核。破骨细胞胞体巨大，直径60～100μm，形态不规则，边缘清楚或不整齐如撕纸状。胞核小且较多，3至几十个，圆形椭圆形，大小较一致，彼此孤立，随意排列，无核丝相连。核染色质较粗糙。胞质极丰富，呈红蓝相间色，胞质中有较多较细小，大小不均排列稀疏的紫红色颗粒。正常成人骨髓涂片直接推片，不需用血清稀释。

在新药安全评价试验中，Beagle犬的骨髓像很容易受到抗肿瘤药或者免疫抑制剂如环磷酰胺、米托恩醌的影响发生改变，可见骨髓三系收到明显抑制，淋巴细胞大量增多，形成骨髓空洞，停药半个月至1个月后恢复正常骨髓像。这可能和药物剂量以及动物本身的个体差异有关联。由本次研究得出Beagle犬骨髓有核细胞分类值和粒红比值在性别上有不同。正常成人骨髓有核细胞计数值和粒红比值不分性别，但是儿童骨髓特征有核细胞较成人丰富，幼儿骨髓淋巴细胞值较成人偏高。幼年动物（4～6个月龄的Beagle犬）的骨髓像粒系和红系与儿童骨髓像相似，红系偏高。体质较差的Beagle犬呈贫血性骨髓像，镜下可见嗜酸，嗜碱粒细胞增多，也可见血液寄生虫[9]。

本次研究显示Beagle犬正常骨髓像各细胞系，各阶段细胞的比值在正常范围，互相间的比例也正常。Beagle犬和正常成人在骨髓有核细胞增生程度，有核细胞三系（粒系，红系，巨核系），淋巴细胞，非造血细胞的数量和形态学特征等方面存在明显的差异。

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（收稿日期：2015-10-09）