姜　丹　彭晓宇　山东省荣成市崂山畜牧兽医站264300

孙丽丽　山东省荣成市荫子畜牧兽医站264300

鸭疫里氏杆菌对氟苯尼考耐药性的研究

姜丹彭晓宇山东省荣成市崂山畜牧兽医站264300

孙丽丽山东省荣成市荫子畜牧兽医站264300

鸭疫里氏杆菌病是由鸭疫里氏杆菌感染而致，又称鸭传染性浆膜炎，是一种主要侵害雏鸭的接触性传染病，临床特点是困倦、厌食、眼和鼻孔有分泌物、下痢、共济失调和抽搐，是目前养鸭业中最为严重的细菌性传染病之一。本实验测定了10种常用抗菌药对8株鸭疫里氏杆菌的敏感性。结果表明，对头孢曲松钠和硫氰酸红霉素的耐药率达100％；其次为庆大霉素和头孢喹诺，耐药率为87.5％；而对氟苯尼考的耐药率为50％。

鸭疫里氏杆菌；氟苯尼考；耐药机制

鸭疫里氏杆菌病是由鸭疫里氏杆菌引起的鸭、鹅、火鸡等多种禽类共患的一种急性或慢性、接触性传染病［1］，又称为鸭传染性浆膜炎。鸭疫里氏杆菌对多种抗菌素极易产生耐药性，治疗时应根据药敏试验结果选用敏感药物。鸭疫里氏杆菌一般对氟苯尼考、恩诺沙星、环丙沙星、新霉素、土霉素和盐酸林可霉素均较敏感，而对青霉索、链霉素、磺胺六甲氧嘧啶不敏感［2］。

1　实验材料

（1）鸭疫里氏杆菌菌株来源。某鸭疫里氏杆菌病发病鸭场临床分离的8株鸭疫里氏杆菌。

（2）药品。氟苯尼考（含量为90％，批号040301，江西博莱大药厂），左氧氟沙星（含量：90.5％，批号：200611038639，岳阳同联药业），头孢曲松钠（批号：20090101，山东鲁抗医药股份有限公司），头孢喹诺（含量：中国兽药监察所），硫氰酸红霉素（效价：783.4U/mg，批号：200709120，岳阳同联药业），硫酸庆大霉素（批号：GENTAMYCIN1005081，邯郸市第二制药厂），恩诺沙星（含量：98.5％，批号：NA00N100108-A，浙江新华药厂），盐酸环丙沙星（批号：060630-7，浙江国邦药厂），阿莫西林（含量：99％，批号：08060507，华北制药集团先泰药业有限公司），磺胺嘧啶（含量：99.45％，批号：080335，昆山双鹤药业）。

（3）各种试剂。LB培养基、酵母浸出物、水解酪蛋白为Oxoid产品。固体培养平板为LB液体培养基加入1.6％琼脂，分装平皿后灭菌。生化微量鉴定管，杭州天和微生物试剂有限公司出品。琼脂糖淀粉购于Oxoid公司，TAE缓冲液、Golden view核酸染料试剂购于原平皓生物公司（1009081）。

2　实验方法

（1）鸭疫里氏杆菌细菌的培养与生化试验鉴定。菌株复苏、活化、传代。用接种环蘸取冻存于-20℃条件下的RA甘油菌少许，划线接种于琼脂LB平板上，倒置于温箱中，37℃下培养24小时。待平板上长出单个菌落，挑取形态均一的单个菌落，接种于含3mL LB的试管中，37℃下振荡培养12～16小时，待菌株生长，再传代接种于LB培养基中，多次传代至0.5～0.6个麦氏比浊浓度。37℃恒温保存，备用。

按常规方法进行糖发酵试验、靛基质试验、硫化氢试验、VP、枸橼酸试验等生化特性试验［3］。

（2）临床分离鸭疫里氏杆菌对指示药物的敏感性试验。纯培养好的菌液使用前稀释1000倍。采用CLSI推荐的微量稀释法测定各药对细菌的MIC［4］。将细菌接种于LB培养基中，37℃温箱培养过夜，使细菌浊度达到9×108个/mL，取无菌96孔培养板，将上述菌液作1∶1000倍稀释，除第1孔加入稀释菌180μL外，其余的各孔均加入100μL。继之于第1孔加入抗生素原液20μL（320μg/ml）充分混合后吸出100μL加入第2孔中，按同法稀释至第11孔，弃去100μL，第11孔为细菌对照，第12孔为培养基对照。将培养板37℃下培养16～24小时，观察结果。凡药物最高稀释孔中无细菌生长者，该孔的浓度为最低抑菌浓度（MIC）。

3　结果与分析

（1）细菌培养、细菌生化试验结果。菌株接种LB板，经37℃培养24～48小时后，为光滑、微突起、透明、奶油状、直径为l.0mm～2.0mm的菌落，04#菌株直径较小并呈双排排列。在半固体琼脂培养基上沿穿刺线上生长，没有发现该细菌具有运动性。糖发酵、靛基质、V-P、枸椽酸盐、尿素酶和硫化氢试验（表1），符合鸭疫里氏杆菌的生化特性［5］。

（2）MIC的测定。结果根据CLSI（2008）中10种药物MIC标准进行判定，分离得到的8株鸭疫里氏杆菌，其中氟苯尼考耐药率为50％，阿莫西林耐药率为25％，头孢噻呋耐药率为37.5％，头孢喹诺耐药率为87.5％，头孢曲松钠耐药率为100％，左氧氟沙星耐药率为12.5％，环丙沙星耐药率为25％，恩诺沙星耐药率为25％，庆大霉素耐药率为87.5％，硫氰酸红霉素耐药率为100％。其中有两株菌株10.09.02 04#和10.09.14 06#菌对氟苯尼考、头孢喹诺、头孢曲松钠、庆大霉素和硫氰酸红霉素呈高度耐药，其最小抑菌浓度（MIC）值均≥128μg/mL。其它药物对这两株菌的最小抑菌浓度差异性较大。

4　讨论

（1）鸭疫里氏杆菌生化反应。本试验共研究鸭疫里氏杆菌2株，采用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉水解、靛基质、H2S、明胶、甘露醇、vp等生化反应对其进行鉴定。经多次鉴定试验，发现两株菌株除葡萄糖和蔗糖发酵鉴定结果与文献报道不符，其他生化反应均一致。这种生化反应的异同可能是由于受到环境中温度、湿度、紫外线等各种理化因素变化的影响，在动物体内则是受到各种细胞因子、抗生素的选择性压力的影响，从而造成细菌发生基因突变，使某些生化反应不稳定，容易出现假阳性和假阴性的结果［6］。

（2）药物敏感性。鸭疫里氏杆菌对β-内酰胺类抗生素如阿莫西林、氨苄西林、亚胺培南、头孢噻肟、头孢曲松、头孢吡肟的敏感性较高，其中亚胺培南、头孢吡肟抗菌活性最高，它们对所有菌株的最小抑菌浓度（MIC）值较低［7］。头孢吡肟主要抑制细胞壁肽多糖的形成，通过抑制细菌细胞壁的合成而产生杀菌作用，能耐受多种β—内酰胺酶的破坏，因此抗菌活性较高。

鸭疫里氏杆菌对氟喹诺酮类药物环丙沙星敏感，其MIC值均≤32μ/mL。氟喹诺酮类药物（FQs）具有抗菌谱广、临床疗效好及可多途径给药的优点，在临床实践应用中与其他抗生素无交叉耐药性。鸭疫里氏杆菌对氨基糖苷类药物阿米卡星、庆大霉素也较敏感，氨基糖苷类药物具有抗菌谱广性质稳定及水溶性好等优点。四环素类药物多西环素对鸭疫里氏杆菌的MIC值均≤16μ/mL。该类药物具有内服吸收迅速、生物利用度高及组织渗透力强等优点。其它药物由于菌株之间的差异性和不同地区用药不同而表现出不同的敏感性。鸭疫里氏杆菌很容易产生耐药性，杀灭此菌可根据药敏试验选用敏感药物。药物治疗短期内有一定效果，但连续使用很快就会产生耐药性。因此每次用药前均需进行药敏试验以确定首选药物，也可采用联合用药方式，提高治疗效果。

［1］Calnek B W．禽病学［J］．第9版．高福，刘文军，主译．第lO版，北京：北京农业大学出版社，1991．153-l57．

［2］陈金敏，王秀丽，李文义，等.雏鸭传染性浆膜炎的诊断与防制［J］.养殖与饲料，2007（03）：39．

［3］张大丙，郭玉璞．不同血清型鸭疫里氏杆菌分离株的生化特性比较［J］．中国兽医杂志，1999，2（5）：13-15．

［4］Performance standards for antimiarobial susceptibility testing eighteenth informational supplement.CLSI document MI00一S18［S］．Wayne，Pennsylvania，Cinical and Laboratory Standards lnstitute，2008，28（1）：1-83．

［5］刘伟华，赵艳丽，王玉海，等．鸭疫里默氏菌研究进展［J］．动物医学进展，2008，29（5）；91-93．