袁程　许新华

443003　湖北省宜昌市，三峡大学第一临床医学院(袁程)；湖北省宜昌市中心人民医院(许新华)



·综述与讲座·

microRNA在鼻咽癌上皮间质转化中的作用

袁程许新华

443003湖北省宜昌市，三峡大学第一临床医学院(袁程)；湖北省宜昌市中心人民医院(许新华)

【摘要】鼻咽癌是一种发病率较高的头颈部恶性肿瘤,临床治疗上主要以放化疗为主。上皮间质转化是恶性肿瘤细胞获得浸润、迁移能力的重要机制,该过程中涉及多种microRNA的参与以及其他因子或基因信号通路的调控。本文就鼻咽癌上皮间质转化过程中涉及microRNA参与机制的研究进展作一综述。

【关键词】鼻咽肿瘤;上皮间质转化;microRNA

上皮间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)是指多种类型的上皮极化细胞由于失去了细胞间的连接，获得运动和侵袭能力，最终以间充质为特征的复杂过程[1]。EMT涉及体内多种细胞的分化以及组织、器官修复的过程，同时也可以导致组织纤维化，此外，EMT被认为是肿瘤获得转移能力的一个重要过程，其发生机制可能涉及赋予肿瘤细胞迁移和侵袭的特性、诱导干细胞的潜能、防止细胞衰老和凋亡等多方面，随着近年来对EMT研究的不断深入以及大量的研究结果证实，EMT已成为研究恶性肿瘤浸润、转移的世界性前沿课题[2]。MicroRNA(miRNAs)是一类进化上高度保守的，具有20～24个左右核苷酸长度的，在基因表达调控过程中有重要作用的非编码RNA[3,4]。20世纪90年代，通过对突变体线虫的研究首次发现了miRNA[5]。此后的一些研究中发现，哺乳动物大部分的miRNAs是由RNA聚合酶Ⅱ转录的基因编码，目前已知的近三分之一miRNAs嵌入在蛋白质编码基因的内含子以及与宿主基因共转录，这些miRNAs能够调控miRNAs和蛋白质的表达[5,6]。随后的研究中发现，miRNAs能抑制靶基因表达，导致目标蛋白表达水平降低，影响细胞增殖、分化和凋亡等过程，异常表达的miRNAs最终可以导致包括肿瘤在内的多种疾病的发生[4]。

1鼻咽癌与上皮间质化

1.1EMT在鼻咽癌中的作用EMT是多细胞动物胚胎、慢性炎症和纤维化形成的关键因素，已被证明是在肿瘤侵袭和转移的主要机制[7]。鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)的发生机制尚未完全阐明，普遍认为其发病与爱泼斯坦-EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)关系密切。EBV的病理生理机制以及分子介导关系尚处于研究阶段，目前已知EBV的三种主要蛋白编码基因分别为EBNA1、LMP1、LMP2,这些基因均编码大量病毒核心小RNA (virus-encoded small RNAs，EBERs)以及miRNAs。

LMP1基因与NPC发病机制密切相关，并通过参与调节肿瘤干细胞(Cancer stem cells，CSCs)分子标记的表达(CD44高表达、CD24低表达)促进NPC细胞EMT；Thiery[8]研究发现，肿瘤的发生过程中，一个关键的上皮细胞粘附分子——钙粘素(E-cadherin)的下调，是EMT的标志性事件，后期研究进一步证实NPC E-cadherin分子表达下调，具体机制可能与LMP1基因和表观遗传学的领域相关[9]。

对LMP2的研究发现，在mRNA水平有超过95%NPC样本中已经发现了LMP2A，在蛋白质水平也达到了50%；与之相比的LMP1在mRNA水平以及蛋白质水平分别为65%和35%[7]。Kong等[7]研究证实外源LMP2A表达上调可以增加NPC的侵袭、迁移能力，诱导EMT样细胞标志物的改变，并刺激干细胞侧群和干细胞标记物的表达。

1.2介导 NPC 细胞发生 EMT 的相关因子

1.2.1E-cadherin:E-cadherin是一种细胞间粘附、连接的介质，有相关研究证实E-cadherin通过调控多种细胞内信号转导途径并影响基因的表达，E-cadherin介导的细胞粘附系统功能障碍在肿瘤侵袭、转移的进展中发挥着重要作用[10,11]。在对大肠癌的研究中发现，肿瘤细胞发生EMT的过程中会伴随着E-cadherin的丢失、细胞核β-cadherin的定位[12]。此外进一步的研究中发现，EMT过程中E-cadherin基因出现了启动子甲基化、转录抑制、蛋白磷酸化和降解等一系列现象[13]。Wang等[14]在对NPC侵袭与转移的研究中发现白介素-17A(IL-17A)通过调节基质金属蛋白酶-2/-9(MMP-2/-9)的表达和EMT过程，促进NPC的侵袭和转移，在这一过程中伴随着E-cadherin的表达下调。总之，E-cadherin表达下调已被视为EMT的一个重要标志[15]。

1.2.2转录因子:在肿瘤EMT过程中，涉及多种转录因子(transcription factor,TF)的参与，目前已有研究证实的主要为Twist1、Snail1、Snail2、Zeb1和Zeb2等，而这一系列参与EMT的TFs能直接或间接地导致E-cadherin表达水平下调[16]。多种TFs在EMT进程中被证实能够调控E-cadherin基因启动子序列以及组蛋白去乙酰化[17]。以Snail为例，Horikawa等[18]通过EBV LMP1在转移性NPC中进行诱导Snail和EMT的研究中发现，Snail在NPC中呈现过表达状态，且这种过表达状态与NPC的转移密切相关；随后在NPC EMT的研究中证实了Snali与E-cadherin呈独立的负相关性。Yu等[19]的研究中也证实了Snail2与E-cadherin的负相关性。

1.2.3转化生长因子-β:生长因子(growth factor，GF)介导EMT的研究目前主要集中在转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)。TGF-β与EMT在肿瘤的发生和进展过程中紧密联系，研究发现TGF-β在超过50%的NPC患者中表达下调，通过干预TGF-β信号以及抑制TGF-β受体激活PI3K/Akt通路，可进一步促进NPC细胞失控性生长、侵袭、转移和EMT过程[20,21]。flotillin-2(flot2)是TGF-β信号中的主要分子，Zhao等[22]的研究发现通过抑制flot2可以导致E-cadherin表达上调以及β-cadherin蛋白的抑制，这一发现为通过抑制TGF-β治疗NPC EMT提供了新的思路。

2与NPC EMT相关的miRNAs

EMT的机制涉及一整套精细转录因子、生长因子以及其他信号分子等调控，这些因素之间构成了一个庞大的相互作用的网络，通过miRNAs的作用，使这些信号能够从多个传感器信号近端接收并传递到微环境基因表达[23]。参与NPC EMT的miRNAs种类繁多，同时涉及其他基因和分子的参与或调控，目前研究较清楚的有miR-9、miR-155、miR-10b等。

2.1miR-9Song等[24]研究认为，miR-9能够促进细胞迁移以及肿瘤的转移，沉默miR-9的表达后，肿瘤的迁移和转移受到抑制，进一步研究发现miR-9可以作用于E-cadherin的3′-非翻译区并使其表达下调。此外通过对食管癌的研究也证实了miR-9可以诱导EMT，使肿瘤细胞具有转移能力。Gwak等[25]在对乳腺癌的研究中进一步阐述了miR-9与EMT之间的相互作用。Lu等[26]通过对鼻咽癌患者血浆的研究，发现miR-9与鼻咽癌患者的转移有相关性，并认为miR-9可能成为预测鼻咽癌转移的一个生物标志物同时可以用于检测肿瘤动力学。另外Gao等[27]认为，miR-9与EMT之间的相互作用是鼻咽癌转移的重要原因，并通过进一步研究其机制后发现，miR-9可以调节肿瘤细胞中人类干扰素诱导基因和MHCC Ⅰ类分子的表达，这一发现将炎症与肿瘤发生之间的联系构建了一个新的解释。

2.2miR-155miR-155是一种多功能的miRNA，在人体内调节多种生命活动，涉及肿瘤、心血管疾病以及病毒感染性疾病的发生，而在EMT的过程中以往研究很少涉及miR-155的作用[28]。但是Dai等[28]认为，miR-155可以作用于TCF4和AGTR1(已知与EMT关系密切的两个基因)两个基因。Du等[29]通过原位杂交技术观测NPC肿瘤细胞与正常人的鼻咽部上皮细胞的miR-155，发现在NPC细胞中miR-155表达显著增高，而且在与之相邻的正常上皮细胞中，miR-155明显低表达，通过进一步研究后发现，NPC细胞中miR-155的高表达是受到LMP1、LMP2的诱导作用。张余琴[30]的研究进一步验证了在NPC细胞株中miR-155对EMT的影响：采用qRT-PCR技术观察到NPC细胞中miR-155的高表达以及上皮细胞标志物E-cadherin、α-catenin的下调，间质细胞标志物N-cadherin、vimentin的表达上调。

2.3miR-10bYe等[31]利用慢病毒转导技术，使大鼠的miR-10b水平增高，用以观察大鼠肿瘤细胞侵袭能力，实验中发现miR-10b可以使肿瘤的侵袭能力增强，同时发现这些肿瘤组织中有类似于CSCs特性的细胞存在，以及E-cadherin的下调。此外，Han等[32]的研究中发现miR-10b是TGF-β1的靶向分子，在TGF-β诱导EMT的乳腺癌细胞中miR-10b高表达，进一步研究中发现对miR-10b抑制可以部分逆转EMT。张配[33]在miR-10b调控EMT及其对NPC细胞侵袭和迁移能力影响的实验中，通过转染实验发现miR-10b mimics转染后能使HNE1细胞形态学上产生上皮样变以及EMT相关标记物(E-cadherin、vimentin、MMP-9)也出现相应改变，而miR-10b inhibitors却出现相反的情况，进一步研究发现miR-10b表达增强可以使NPC细胞侵袭周围组织的能力增强；抑制miR-10b的表达使NPC细胞侵袭能力降低。即miR-10b可以促进NPC EMT，抑制miR-10b表达可以不同程度的逆转EMT。

2.4其他miRNAs

2.4.1miR-156a:田允鸿[34]从西兰花组织中提取出miR-156a并作用于NPC细胞株，发现miR-156a能与人交界粘连分子(junctional adhesion molecule-A,JAM-A)的mRNA结合，进而抑制NPC细胞株的EMT过程和干细胞特性。

2.4.2miR-149:Luo等[35]采用MTT测定法发现miR-149可以调控NPC肿瘤组织的增殖，在随后的伤口愈合实验中观察到miR-149使NPC侵袭能力增强，另外miR-149与E-cadherin的表达也存在负相关性。

3EGF和PTEN基因对miRNAs在EMT过程中的影响

3.1表皮生长因子表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)以及表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGF-R)之间信号通路的平衡状态维持着细胞生长、增殖以及分化等重要的生理活动，且目前已被证实与人类多种肿瘤的发生发展具有相关性，当EGF-R被激活后调节正常和恶性上皮细胞EMT相关的侵袭和迁移，采用单克隆抗体或酪氨酸激酶抑制剂阻断EGF-R后，可以阻滞EMT进而抑制肿瘤的侵袭和转移[36]。

Kao等[37]认为EGF可以下调miR-30的表达，通过对EGF的3'非翻译区突变分析后发现EGF是miR-30的直接靶向分子，过表达的miR-30可以促进EMT表型以及肿瘤细胞的迁移和侵袭。2012年何威[38]通过EGF成功诱导了NPC EMT，通过测定后发现有8种miRNAs上调以及4种miRNAs下调，并认为EGF在诱导NPC EMT过程中，与miRNAs之间形成了一个复杂而庞大的网络，其中EGF对miRNAs的调控具有关键性作用。

3.2PTEN基因人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)是经典的肿瘤抑制基因，该基因编码的蛋白质是具有403个氨基酸的多功能蛋白，具有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶的活性[39]。在一项对肝纤维化的研究中发现，miR-21是调节EMT与PTEN/AKt信号通路的关键分子[40]。通过对耐药胶质瘤细胞的研究发现，miR-221与EMT之间会受到PTEN的调控，在具体试验中表现为药物敏感肿瘤细胞中出现PTEN过表达，在vimentin、p-Akt and MRP1显著下调同时E-cadherin明显上调[41]。

Cai等[42]对NPC与EBV进行了深入研究，发现在NPC细胞中高度表达EBV-miR-BART7-3p，而这与淋巴结转移、临床分期正相关，针对EBV-miR-BART7-3p的主要抑癌基因PTEN，通过人为调节PI3K/Akt/GSK-3β信号通路能够使Snail、β-catenin高表达以及在细胞核中积累，这一过程促进了EMT。此外该研究还指出敲除PTEN可能拟表型EBV-miR-BART7-3p效果，而PTEN表达则导致表型的逆转，这一研究发现可能使EBV-miR-BART7-3p成为一个潜在的生物标志物或治疗靶点。

miRNAs是近些年来兴起的研究热点，其种类繁多，与多种疾病具有相关性，对于转移性肿瘤尤其是针对EMT的可逆性过程研究取得了很多进展[43]。由于miRNAs与EMT是一个庞大的信号网络，又涉及到其他信号途径的影响和肿瘤抑制基因的调控，而这之间的相互促进、相互制约的复杂机制尚未阐明，很多实验中通过对miRNAs直接或间接的上调或下调还不能完全逆转EMT。随着对NPC EMT与miRNAs的相关性研究的深入，将为NPC的诊断、预后以及转移、复发的判断开辟一个新的途径，甚至可以衍生出相关的潜在生物学标志物和治疗靶点，这为NPC的研究以及临床治疗提供新的希望。

参考文献

1Cicchini C,Amicone L,Alonzi T,et al.Molecular mechanisms controlling the phenotype and the EMT/MET dynamics of hepatocyte.Liver international:official journal of the International Association for the Study of the Liver,2015,35:302-310.

2Thiery JP,Acloque H,Huang RY,et al.Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease.Cell,2009,139: 871-890.

3Ebert MS,Sharp PA.Roles for microRNAs in conferring robustness to biological processes.Cell,2012,149: 515-524.

4Lujambio A,Lowe SW.The microcosmos of cancer.Nature,2012,482: 347-355.

5Mendell JT,Olson EN.MicroRNAs in stress signaling and human disease.Cell,2012,148: 1172-1187.

6Kim YK,Kim VN.Processing of intronic microRNAs.The EMBO journal,2007,26:775-783.

7Kong QL,Hu LJ,Cao JY,et al.Epstein-Barr virus-encoded LMP2A induces an epithelial-mesenchymal transition and increases the number of side population stem-like cancer cells in nasopharyngeal carcinoma.PLoS Pathogens,2010,6:e1000940.

8Thiery JP.Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression.Nature reviews Cancer,2002,2:442-454.

9Yoshizaki T,Kondo S,Wakisaka N,et al.Pathogenic role of Epstein-Barr virus latent membrane protein-1 in the development of nasopharyngeal carcinoma.Cancer letters,2013,337:1-7.

10Du W,Liu X,Fan G,et al.From cell membrane to the nucleus: an emerging role of E-cadherin in gene transcriptional regulation.Journal of cellular and molecular medicine,2014,18:1712-1719.

11Nagathihalli NS,Merchant NB.Src-mediated regulation of E-cadherin and EMT in pancreatic cancer.Frontiers in bioscience (Landmark edition),2012,17:2059-2069.

12Tiwari N,Gheldof A,Tatari M,et al.EMT as the ultimate survival mechanism of cancer cells.Seminars in cancer biology,2012,22: 194-207.

13Tsai JH,Yang J.Epithelial-mesenchymal plasticity in carcinoma metastasis.Genes & development,2013,27: 2192-2206.

14Wang L,Ma R,Kang Z,et al.Effect of IL-17A on the migration and invasion of NPC cells and related mechanisms.PloS One,2014,9:e108060.

15Lin Y,Dong C,Zhou BP.Epigenetic regulation of EMT: the Snail story.Current pharmaceutical design,2014,20:1698-1705.

16Tania M,Khan MA,Fu J.Epithelial to mesenchymal transition inducing transcription factors and metastatic cancer.Tumour biology : the journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine,2014,35:7335-7342.

17Garg M.Epithelial-mesenchymal transition-activating transcription factors-multifunctional regulators in cancer.World journal of stem cells,2013,5:188-195.

18Horikawa T,Yoshizaki T,Kondo S,et al.Epstein-Barr Virus latent membrane protein 1 induces Snail and epithelial-mesenchymal transition in metastatic nasopharyngeal carcinoma.British journal of cancer,2011,104:1160-1167.

19Yu C,Chen L,Yie L,et al.Targeting FoxM1 inhibits proliferation,invasion and migration of nasopharyngeal carcinoma through the epithelialto-mesenchymal transition pathway.Oncology reports,2015,33:2402-2410.

20Morrison CD,Parvani JG,Schiemamnn WP.The relevance of the TGF-beta Paradox to EMT-MET programs.Cancer letters,2013,341:30-40.

21Lyu X,Fang W,Cai L,et al.TGFbetaR2 is a major target of miR-93 in nasopharyngeal carcinoma aggressiveness.Molecular cancer,2014,13:51.

22Zhao L,Lin L,Pan C,et al.Flotillin-2 promotes nasopharyngeal carcinoma metastasis and is necessary for the epithelial-mesenchymal transition induced by transforming growth factor-beta.Oncotarget,2015,6:9781-9793.

23Ansieau S,Collin G,Hill L.EMT or EMT-Promoting Transcription Factors, Where to Focus the Light.Frontiers in oncology,2014,4:353.

24Song Y,Li J,Zhu Y,et al.MicroRNA-9 promotes tumor metastasis via repressing E-cadherin in esophageal squamous cell carcinoma.Oncotarget,2014,5:11669-11680.

25Gwak JM,Kim HJ,Kim EJ,et al.MicroRNA-9 is associated with epithelial-mesenchymal transition, breast cancer stem cell phenotype,and tumor progression in breast cancer.Breast cancer research and treatment,2014,147: 39-49.

26Lu J,Xu X,Liu X,et al.Predictive value of miR-9 as a potential biomarker for nasopharyngeal carcinoma metastasis.British journal of cancer,2014,110: 392-398.

27Gao F,Zhap ZL,Zhao WT,et al.miR-9 modulates the expression of interferon-regulated genes and MHC class I molecules in human nasopharyngeal carcinoma cells.Biochemical and biophysical research communications,2013,431:610-616.

28Dai W,Zhao J,Tang N,et al.MicroRNA-155 attenuates activation of hepatic stellate cell by simultaneously preventing EMT process and ERK1 signalling pathway.Liver international:official journal of the International Association for the Study of the Liver,2015,35:1234-1243.

29Du ZM,Hu LF,Wang HY,et al.Upregulation of MiR-155 in nasopharyngeal carcinoma is partly driven by LMP1 and LMP2A and downregulates a negative prognostic marker JMJD1A.PLoS One,2011,6:e19137.

30张余琴.鼻咽癌中miR-155功能的初探.南方医科大学,2012.

31Ye P,Wang T,Liu WH,et al.Enhancing HOTAIR/MiR-10b drive liver normal stem cells to arise malignant transformation tendency through inducing epithelial-mesenchymal transitions.Rejuvenation research,2015,18:332-340.

32Han X,Yan S,Weijie Z,et al.Critical role of miR-10b in transforming growth factor-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in breast cancer.Cancer gene therapy,2014,21: 60-67.

33张配.microRNA调控上皮-间质转化的机制及其对鼻咽癌细胞侵袭和迁移的影响.蚌埠医学院,2014.

34田允鸿.miR156a通过JAM-A蛋白抑制鼻咽癌细胞株上皮间充质转化,南方医科大学,2014.

35Luo Z,Zhang L,Li Z,et al.miR-149 promotes epithelial-mesenchymal transition and invasion in nasopharyngeal carcinoma cells.Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban,2011,36:604-609.

36Almoustafa AE,Achkhar A,Yasmeen A.EGF-receptor signaling and epithelial-mesenchymal transition in human carcinomas.Frontiers in bioscience (Scholar edition),2012,4:671-84.

37Kao CJ,Martninez A,Shi XB,et al.miR-30 as a tumor suppressor connects EGF/Src signal to ERG and EMT.Oncogene,2014,33: 2495-2503.

38何威.生长因子诱导的鼻咽癌细胞上皮-间质转换过程中的mRNA-microRNA调控网络.中南大学,2012.

39Milella M,Falcone I,Conciatori F,et al.PTEN: Multiple Functions in Human Malignant Tumors.Frontiers in oncology, 2015, 5:24.

40Liu Z,Wang J,Guo C,et al.microRNA-21 mediates epithelial-mesenchymal transition of human hepatocytes via PTEN/Akt pathway.Biomedicine pharmacotherapy Biomedecine pharmacotherapie,2015,69:24-28.

41Xie Q,Huang Z,Yan Y,et al.miR-221 mediates epithelial-mesenchymal transition-related gene expressions via regulation of PTEN/Akt signaling in drug-resistant glioma cells.Nan fang yi ke da xue xue bao = Journal of Southern Medical University,2014,34:218-222.

42Cai LM,Lyu XM,Luo WR,et al.EBV-miR-BART7-3p promotes the EMT and metastasis of nasopharyngeal carcinoma cells by suppressing the tumor suppressor PTEN.Oncogene,2015,34:2156-2166.

43Diaz-Lopez A,Moreno-Bueno G,Cano A.Role of microRNA in epithelial to mesenchymal transition and metastasis and clinical perspectives.Cancer management and research,2014,6:205-216.

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.11.033

通讯作者:许新华,443002湖北省宜昌市中心人民医院；

【中图分类号】R739.6

【文献标识码】A

【文章编号】1002-7386(2016)11-1704-04

(收稿日期：2015-10-21)

项目来源：湖北省自然科学基金计划项目(编号：2011CDB330，2014CFB312)；湖北省医学科学研究重点课题(编号：JX4B52)

E-mail:xuxinhua@medmail.com.cn