刘睿华（湖北省恩施州动物疫病预防控制中心，湖北 恩施 445000）

血凝和血凝抑制试验的影响因素分析

刘睿华
（湖北省恩施州动物疫病预防控制中心，湖北 恩施 445000）

血凝和血凝抑制试验在疫病防控中应用非常广泛，但影响试验结果的因素较多。针对试验中缓冲液、红细胞、抗原、样品、温度和时间、试验器材和耗材、结果判定等因素对试验的影响进行了分析。

血凝血凝抑制影响因素分析

某些病毒能够与哺乳类或禽类的红细胞发生凝集，利用这一特性可以检测样品中是否有病毒存在，或测定病毒的效价，即血凝试验。这种红细胞凝集现象可被特异性抗体所抑制，即血凝抑制试验。这两种方法可用于病毒鉴定、病毒性疾病的诊断、动物群体性疫情的监测、抗体效价的监测以及病毒抗原变异的监测。HA-HI试验具有可比较性和可重复性、特异性好、操作方便、对试验环境要求不高等优点，但试验中也收到很多因素影响，其中一些因素甚至能严重影响试验结果。现总结一些经验，供大家参考。

1　PBS缓冲液

PBS缓冲液在配制红细胞悬液、抗原、试验过程中都需要用到，并且应保持一致性。PBS缓冲液应现用现配，并将pH值调到7.2，如果配制时间过长，pH值会发生变化，影响试验结果。

2　红细胞

2.1来源

配置红细胞最好选用成年SPF公禽，但大多地区很难购买，也可选用非免疫健康公禽。如果仅采集一只禽制作红细胞，可能产生自凝现象，因此应至少采集3～4只禽血液混合后制作。红细胞的采集最好选用与待检血清同种禽类，否则会出现非特异性凝集现象，有时会严重影响结果判定。

2.2配制

2.2.1浓度血凝和血凝抑制试验一般配制1%浓度红细胞悬液。不同浓度的红细胞对效价有一定影响，当红细胞浓度过高，沉降的血点过大，测出的血凝效价可能偏低，血凝抑制效价可能偏高；当红细胞浓度过低，沉降的血点过低，且沉降速度较慢，测出的血凝效价可能偏高，血凝抑制效价可能偏低。

2.2.2溶血采血时过度摇晃容器或离心红细胞时速度过快、时间过长，容易导致红细胞破裂，红细胞悬液浓度变低，影响试验结果的观察。

2.3保存

配制好的红细胞悬液应保存于2～8℃，且不超过2 d，以免保存时间过长或受细菌污染均可发生自凝，影响试验结果。

3　抗原

3.1配制

抗原的配置浓度对试验结果影响很大。如果抗原浓度降低，测得的抗体效价增大；抗原浓度升高，测得的抗体效价减小。因此在测样品效价之前应对配制好的抗原进行滴定试验，如果抗原浓度不准确，应进行校正。

3.2保存

抗原应现配现用，配制好的抗原应保存于2～8℃，且不超过2 d，也可-70℃保存，随用随取，切忌反复冻融，否则抗原效价会降低。

4　样品

被检样品要求新鲜、透明、无杂质、无溶血、不腐败。当血清被细菌严重污染或腐败后，血清会变浑浊，变质的血清会发生凝集反应，使含较高抗体的血清在血凝抑制试验中出现前几孔凝集［1］，而后几孔凝集被抑制的现象。

5　温度和时间

试验要求反应温度在20～25℃，温度低反应时间变长，出现结果变慢；温度高反应时间变短，出现结果变快。抗原抗体反应时，如果温度在20～25℃，必须反应30 min以上。加入红细胞反应时，温度低于4℃，红细胞易发生自凝；高于37℃，凝集的红细胞易洗脱。当温度为4℃时，反应时间25 min为最佳读取结果时间；25℃时，反应时间20 min为最佳读取结果时间；37℃时，反应时间15 min为最佳读取结果时间。试验结果出现后，应及时读取结果。如不及时读取，则红细胞开始解凝，温度越高，解凝越快。4℃反应50 min开始解凝，25℃反应40 min开始解凝，37℃反应30 min开始解凝。

6　试验器材和耗材

6.1反应板

反应板有U型和V型两种，V型有90°和120°两种。一般选择96孔90°V型反应板进行HA-HI试验。使用一次性反应板可以避免使用有机反应板因清洗不净或过度磨损而影响结果。使用有机反应板需在每次试验完毕后立即将反应板用自来水反复冲洗，放到2%～3%的盐酸溶液中浸泡24 h以上，捞出用自来水反复冲洗，甩干，再用蒸馏水反复冲洗，甩净蒸馏水放入37℃干燥箱中烘干备用。底部磨损严重的反应板应及时淘汰。

6.2移液器

移液器首先要经过检定计量准确。如果移液器移取的液体量、吸取的液体量或排出的液体量不准确必然会影响试验结果。因此在使用微量移液器前，要检查所用移液器量程是否与要移加的液体量相匹配，刻度是否准确，吸头是否牢固，操作时要做到慢吸快放。

6.3恒温培养箱

能精确保持设定温度。

7　结果判定

试验成功与否根据阴阳性对照和空白对照来判断。HI试验中，如果阳性对照不超过标准值的±1个效价，阴性对照在2log2以下时为100%凝集，空白对照100%阴性，则试验结果正确。HI试验结果判断时，需将反应板倾斜45°，孔底沉淀的红细胞流动性好，呈泪珠样流淌，边缘无凝集颗粒的为凝集完全抑制［2］。试验结果观察要及时，最好每5 min观察一次，避免反应时间过长，已凝集的红细胞被释放，影响结果的判断。

8　结语

影响血凝和血凝抑制试验的因素很多，因此，在进行检测的过程中要注意质量控制，考虑各方面因素，规范操作程序，以降低试验误差。只有获得真实可靠的试验数据，才能科学评价疫苗免疫质量和免疫效果，为疫病防控提供有力的技术支撑。

［1］赵明娟，赵俊勇.温度和时间对血凝试验测定禽流感病毒H5N1亚型Re-6株抗原亚型的影响［M］.畜牧与饲料科学，2014，（35）.

［2］杭柏林，胡建和，刘丽艳，等.影响血凝抑制试验因素的研究发展［M］.贵州农业科学，2009，37（3）.

（编辑：晏兵兵）

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1006-799X（2016）09-0108-02

刘睿华（1987-），女，内蒙古呼和浩特人，助理兽医师，，主要从事动物防疫工作。