曾艺鹏，胡凌红 综述，冯新格 审校

(上海市浦东医院：1.中医科；2.检验科　201399)



·综述·

2型糖尿病患者肠道菌群特异性生物标志物研究进展*

曾艺鹏1，胡凌红2综述，冯新格1审校

(上海市浦东医院：1.中医科；2.检验科201399)

2型糖尿病；肠道菌群；生物标志物

2型糖尿病(T2DM)是一种受遗传和环境双重影响的综合性疾病，而后者被认为是导致发病率增加的主要原因。近年来已有报道肠道菌群与肥胖存在关联[1]，同时有诸多研究报道胰岛素抵抗也是一种低级的炎性反应[2]，而胃肠道菌群兼具基因及环境双重因素。假设肠道菌群对宿主的肥胖表型、代谢及炎性状况具有预测性意义，肠道菌群的分布、基因及代谢产物等可以作为研究人体代谢性疾病的生物性标志物。

1　人体肠道菌群的组成

人肠道中至少存在1 014个微生物，这些微生物基因有数百个人类不具备的基因[3]。这样一个复杂的肠道微生物群，主要由细菌组成，其中大部分不能培养。肠道菌群能增加能量吸收和储存，增加酵解和吸收不消化的糖类[4]。同时肠道菌群参与免疫反应维持肠道免疫系统的动态平衡，如它们在肠道对T细胞亚群分化和B细胞分化成IgA分泌细胞起重要作用[5-6]。肠道菌群主要由3个门的细菌组成，分别是革兰阳性的厚壁菌门和放线菌门，以及革兰阴性的拟杆菌门。目前主要通过16S rRNA技术进行肠道菌群多样性的分析，厚壁菌是最大的菌门，而放线菌门虽然也是一个主要的菌门，但是通过RNA测序通常被遗漏，只能通过荧光原位杂交检测[7]。新生儿肠道菌群的建立起初是通过母亲的产道或皮肤，肠道菌群一开始是定植的兼性需氧菌，随后是厌氧菌。肠道菌群在组成上会保持一种相对的稳定，直至老年，但是只有在许多变量保持不变的情况下才能保持暂时的稳定。如饮食改变能明显影响肠道菌群，在动物实验中，老鼠从高脂肪、高糖饮食转向低脂肪、富含植物多聚糖饮食，在24 h后就能改变肠道微生物菌群结构。一些研究甚至发现，环境与肠道菌群分布更密切，有时甚至超过基因遗传。如，异卵双胞胎和同卵双胞胎的肠道菌群分布都相似[4]，不同小鼠共同生活后肠道菌群结构趋于相似[8]。抗生素的使用是改变肠道菌群的另一个环境因素。一些研究显示采用抗菌药物治疗后，导致肠道菌群大的改变。肠道抗细菌定植作用下降，使得一些外来菌生长，可能导致肠道菌群结构的长期性改变，这种改变可能导致疾病。尽管这些改变的菌种存在个体差异，其中一些不能在治疗后的数月内恢复，事实上大多数个体存在菌种多样性的下降。动物试验发现，研究组小鼠经低剂量的抗菌药物治疗后，会导致代谢活动增加，消化复杂的糖类摄取更多卡路里[9]。这种方式也增加了代谢活动的产物——短链脂肪酸的产量，同时伴随增加了向肝脏门静脉循环的输出量，促进了脂肪合成。

2　肠道菌群与肥胖、胰岛素抵抗及T2DM的关系研究

生活方式的改变和高能量食物的摄取，无疑是世界范围内肥胖病流行的重要因素之一。同时，肠道内菌群通过从食物中摄取能量对新陈代谢活动也会产生影响。而后者被认为是导致肥胖及肥胖并发症(如胰岛素抵抗、糖尿病和心血管疾病)的重要外界环境因素。肠道微生物移植入这些无菌小鼠体内后，可以起到调节其骨质密度、促进脂肪的囤积、促进肠血管生成及促进免疫应答发育的作用[10]。通过宏基因组学和无菌动物模型等技术方法为研究肠道菌群在能量代谢中的作用及其与代谢性疾病之间的联系奠定基础。

肥胖患者肠道内的菌群组成会发生改变，并且可能随着体质量的变化而变化。在人类肥胖病患者的粪便排泄物中，相比对照，厚壁菌门细菌相对较多，而拟杆菌门细菌相对较少。通过限制脂肪或糖类的摄入，体质量减少伴随拟杆菌水平相应提高[1]。在胃旁路手术后体质量降低的肥胖患者身上也出现了类似的情况，这些患者体内拟杆菌和普氏菌的数量与能量和脂肪的摄入量呈负相关[11]。但也有研究并未发现类似现象，甚至有相反的结论，原因可能是因为使用了不同的临床标准(如肥胖的程度、年龄、减肥的强度和热量限制持续的时间)、地理位置、人口规模和微生物分析方法。尽管肥胖和能量摄取可以影响微生物菌群的组成比例，但是否会影响人类肥胖病的机制还不甚清楚。

胰岛素是维持血糖动态稳定的主要激素，通过胰岛素受体的自磷酸化激活其生物学效应。细胞因子和趋化因子分泌可能削弱胰岛素信号通路，在T2DM患者中T细胞分泌更高的IL-17和IFN-γ，导致一种炎症前状态；其他一些细胞因子如TNF-α和IL-6，都与胰岛素抵抗相关。同时，体内固有免疫也能影响胰岛素抵抗，Toll样受体起着重要作用。细菌脂多糖能激活Toll样受体4，上调炎性表达水平，然后诱导胰岛素抵抗。如果Toll样受体4基因变异或被敲除，则可能防止胰岛素抵抗[12]。高脂肪饮食可能会增加革兰阴性菌/革兰阳性菌的比值，致血液脂多糖增加引起内毒素血症和代谢性疾病[13]。动物试验中，对高脂肪饮食老鼠使用抗菌药物能降低血液脂多糖浓度，能缓解糖尿病和肥胖症的指征[14]。

最近有研究报道肠道菌群在T2DM的发展进程中可能起着重要作用[15]，全基因组相关研究(GWAS)为我们进一步认识这一作用打开了一扇窗。研究人员对T2DM患者的肠道菌群进行分析，发现糖膜运输、支链氨基酸运输、甲烷代谢、外源性化合物降解及硫酸盐还原等作用增强；同时，他们也发现丁酸合成、细菌耐药性、鞭毛组装及维生素和辅酶代谢等作用下降[15]。该研究也发现T2DM患者的肠道环境刺激细菌产生对氧应急反应和药物的抵抗。

3　T2DM生物性标志物的筛选与评估

3.1厚壁菌/拟杆菌比值分析肠道微生物群的组成在肥胖人群中有变化，而且它能应对体质量变化。有报道肥胖患者相比对照组，有着特殊的肠道菌群：少的拟杆菌，多的厚壁菌[1,4,7]。拟杆菌随着体质量的下降而增加，暗示拟杆菌可能会影响热量的摄入[1]。另一研究发现胃旁路术导致体质量减轻，对于肥胖人更是降低糖尿病及心血管疾病的风险[11]， 在这些患者中拟杆菌和普雷沃菌水平升高与能量摄入和肥胖呈负相关[11]。 但是也有一些研究不认为厚壁菌与拟杆菌的比例有转换，也有报道指出拟杆菌下降，并非厚壁菌上升，而是放线菌上升[4]。动物实验中，Toll样受体2敲除老鼠表现出厚壁菌相对性升高和稍微高的拟杆菌。但是，它们12周后体质量增加，20周后变胖，提示肠道菌群的改变可以导致肥胖[16]。

Crohn 病研究发现患者在肠道菌群的整体多样性有明显下降，微生物的组成有明显变化[1,10]，T2DM的厚壁菌门比例和梭菌属比例有明显下降[11]。拟杆菌门被认为富含磷酸转移酶系统，参与糖类处理；厚壁菌门富含运输系统。其中有75%与肥胖相关的基因来自放线菌，25%来自厚壁菌；而42%与瘦相关基因来自拟杆菌。功能性分析提示它们中的许多参与糖类、脂质和氨基酸代谢[4,16]。这些发现提示一个核心肠道菌群基因组的存在，影响代谢功能的改变，而不是简单的细菌群多样性或相对丰度的变化[4]。

3.2肠道菌群肠型分析单纯的去研究肠道微生物的不同组分而言，最近提出的肠型(Enterotypes)的研究似乎更有意义。2011年，《Nature》发表了一篇对肠道微生物分型研究的文章，研究者把肠道微生物群落分成了3个肠型[17]，该研究结果被《Science》杂志评为2011年十大科学突破之一。研究人员通过主成分分析根据肠道菌群中的主导微生物，将3个肠型分别称其为肠型1(Enterotype 1)——拟杆菌型、肠型2(Enterotype 2)——普雷沃菌型和肠型3(Enterotype 3)——瘤胃球菌型。瘤胃球菌通常较难分离，部分会归入拟杆菌型[18]。肠型的分类与人的年龄、体质量、性别或国籍不相关，每一个肠型在如何处理能源、产生哪一种维生素、可能影响人类宿主健康的因素等方面有所不同。同时另一个研究小组发现，肠型似乎与饮食相关[18]。例如，肉类饮食使类杆菌属细菌迅速繁殖；而素食则促进普雷沃属细菌迅速繁殖。这两种肠型都不受10 d内饮食限制的影响，表明他们受更长期的饮食趋势的影响。

由154名美国人[4]和85名丹麦人[19]组成的较大样本的肠道微生物组研究也适合分成这3种肠型，这表明在人体肠道内，菌群平衡的肠道菌类型的数量有限。然而有一篇报道不认为T2DM与肠型存在必然联系[20]，因此对肠型与疾病的关联性还需要更多的工作去研究。

3.3细菌基因丰度的分析通过对肥胖和非肥胖人员肠道细菌基因丰度的分析发现，研究组和对照组有不同的基因数量，即丰度[21]，且这些人群中呈现明显的双峰分布。这些基因包括已知和未知菌种的基因，相比高细菌基因丰度的人群，一些具有低基因丰度的人群显示出更突出的肥胖、胰岛素抵抗、糖代谢紊乱等表型。Le等[21]对于大量肠道微生物基因(主要是细菌的基因丰度)在不肥胖和肥胖的个体丹麦人之间的差异进行了描述。作者发现，可以通过以很小一部分细菌种属的基因丰度为基础从而得出整体上细菌基因丰度。其次，低细菌基因丰度的个体要比高细菌基因丰度的个体整体上具有更高水平的脂肪(即肥胖)，并伴有与炎症相关的一些特性。他们还发现，在肥胖志愿者中，那些低细菌基因丰度的个体要比高基因丰度的个体更容易发胖，说明他们具有与炎症相关的肠道微生物群。

Cotillard等[22]证实在肠道低细菌基因丰度的肥胖和超重的人群中通过能量限制的饮食会产生微生物丰度的增高和炎症减少的结果，但这种饮食干预的方法对于那些高基因丰度的人群则不起作用。这一结果说明细菌种类基因丰度在特殊人群中存在差异性分布的特点，同时对于个体对饮食干预的回应能力具有预测性。这一概念的产生使临床研究及药物研发大有可为，因为它为个体患者的药物订制和微生物生态的重新制定开启了新的途径。

3.4宏基因组基因关联群组(MLG)及宏基因簇(MGCs)使用类似GWAS的方法发现都有哪些DNA组出现了问题，再使用所谓的宏基因组关联研究(MGWAS)确定T2DM患者和非T2DM患者体内宏基因组之间的差异。通过这种MGWAS技术他们一共发现了4.2万多个与T2DM有关的基因标志物，这可是一个天文数字，这么多信息在一时之间很难被彻底地消化和处理。所以为了简化问题，消除不必要的冗余信息，研究者又设计了宏基因组基因关联群组(MLG)[23]或是宏基因簇(MGCs)[24]的方法。

根据基因标志物的相对丰度或者分类将T2DM患者和非T2DM患者体内的宏基因组模式加以归纳和提炼，这样就解决了当前在宏基因组分析工作中出现的两个最主要的问题。第一个问题就是到目前为止，我们在进行宏基因组分析工作中采用的分析方法一直都是将测序结果与现有的微生物参考序列进行比对，再根据比对结果推测被测微生物组的微生物组成种类及其功能。但是有很多时候我们得到的测序结果在参考数据库中根本就找不到与之匹配的参考微生物，比如被测的微生物是非常少见的微生物等，所以这些信息也就无法采用，也就不能真正确定被测微生物组到底由哪些微生物组成。不过有了MLG和MGCs方法之后，这些罕见的基因也都可以被纳入规模更大的MLG[23]或MGCs[24]当中，再也不会被漏掉了。第二个问题就是单纯采用分类法也会出现失误，因为基因在微生物之间是可以流动的，而且微生物自身的基因也是会发生变异的，所以简单采用分类的方法进行分析经常会得到错误的结果。

3.5特异性菌群研究发现如果人体内缺少了一种产丁酸盐细菌就容易患上T2DM[23]。丁酸盐是一种可以被肠道细胞使用的能量分子，它也有助于减弱结肠炎性反应。所以如果因为缺失产丁酸盐细菌使得肠道内的丁酸盐含量降低，就会增加肠道内的炎性反应，导致胰岛素抵抗进而患上T2DM。Qin等[23]还发现在T2DM患者的结肠内有机会致病菌增多以及微生物基因组中耐氧化压力基因增多的现象，这些情况也都有助于增加肠道内的炎性反应。

胃旁路术可能具备直接的抗糖尿病作用[25]，具体机制不明，除前面提到的这些人粪便中的微生物群组成发生了改变，提示胃旁路术后肠道菌群改善了患者的代谢表型。特别是一种有益的细菌——柔嫩梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)在肥胖和糖尿病中低丰度，而在术后增加了。普拉梭菌是一种与炎性负相关的生物性标志物，它可能参与调节肥胖和糖尿病中的系统性炎症，而且能改善糖尿病。

摄食菊粉能增加柔嫩梭菌和双歧杆菌水平。同样在饮食诱导肥胖老鼠中，相比同样高脂肪饮食老鼠而未投益生素，益生素能选择性的增加双歧杆菌属，这种增加同时伴肥胖减轻、微生物源炎性分子水平(如脂多糖)降低[19]。人如果增加食用抗性淀粉，会增加粪便中布氏瘤胃球菌(Ruminococcus bromii) 和直肠真杆菌(Eubacterium rectale)水平，它们与纤维素酵解相关[26]。消化抗性淀粉有助于提高胰岛素敏感性[27]，但是不同个体间微生物应对抗性淀粉有差异，因此需要个性化方案[26]。

肥胖更容易从食物中摄取能量，伴随氢元素的转移，与肥胖相关的产氢普氏菌和利用氢气产甲烷古生菌同时增加[28]。动物实验中，如果多行拟杆菌定植老鼠，同时定植史氏甲烷短杆菌会增加食物果聚糖酵解增加。多行拟杆菌制造更多的乙酸和甲酸盐，而史氏甲烷短杆菌利用甲酸盐生成甲烷。这种合作增加了糖类酵解，从肠道吸收更多的能量，相比单独定植多形拟杆菌老鼠更容易导致肥胖[29]。

对这些与临床相关的特异性细菌进行研究，有助于将工作化繁为简，可以应用常规的一些PCR方法对这些细菌进行扩增或定量扩增。通过荟萃分析，我们拟对T2DM患者肠道特异性细菌进行单独或联合检测，验证其在临床的应用效果。

4　小　结

尽管这些生物性标志物分类的方法需要进一步明确，但我们已经很清楚在肠道微生物与人类生理状态之间存在着临床相关的关联性。就像目前研究比较多的肠道菌群与肥胖之间的关联性，微生物的组成以及细菌性基因丰度等指标可以将健康的胖子与患有代谢性疾病的胖子区分开，以及其干预后的反应。将肠道微生物划分成特异性生物标志物将是一个很吸引人的方法，通过集合性的微生物种群组、基因组或菌株等作为一种生物标志物来预测T2DM。

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2015-12-28修回日期：2016-05-17)

上海市浦东新区区科委项目(PKJ2012-Y20)。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.15.035

A

1673-4130(2016)15-2142-04