焦建华，陈海姣，孙怡燕，沈卫东

(东南大学医学院附属江阴医院消化科，江苏 江阴 214400)

自拟活血化瘀方抑制大鼠非酒精性脂肪肝进展的研究

焦建华，陈海姣，孙怡燕，沈卫东

(东南大学医学院附属江阴医院消化科，江苏 江阴 214400)

目的观察自拟活血化瘀中药方抑制缺氧诱导因子(HIF-1α)对大鼠非酒精性脂肪肝进展的影响。方法将48只大鼠按随机分层抽样法分为正常组(8只)、模型组(8只)和处理组(32只)，正常组予以基础饲料饮食，模型组及处理组予以高脂饮食建立大鼠脂肪肝模型，其中处理组每日予以自拟中药活血化瘀方灌胃两次，模型组给于同量生理盐水灌胃，正常组及模型组在实验第16周留取大鼠血清及肝组织，并进行血脂、肝功能指标检测及病理组织检查，处理组分别在干预后第4周、8周、12周、16周按随机抽样法分别留取8只大鼠血清及肝组织标本进行检测。运用Realtime-PCR法检测不同组大鼠肝组织中HIF-1α、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARα)及核转录因子-κB(NF-κB)的mRNA表达差异。结果正常组无肝脏脂肪变性及纤维化发生。处理组在干预8周后，大鼠肝脏脂肪变分期指数为(1.58±0.14)，炎症分级指数为(0.69±0.38)，与模型组的(2.28±0.34)和(1.36±0.44)比较均明显好转，差异有统计学意义(P＜0.05)；处理组HIF-1α表达与模型组相比亦得到显著抑制[(0.892±0.068)vs (1.413±0.139)]，差异有统计学意义(P＜0.05)。在干预12周后，处理组大鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)、三酰甘油(TG)水平分别为(75.17±20.54)U/L、(0.59±0.29)mmol/L，较模型组的(103.17±18.76)U/L、(1.11±0.18)mmol/L明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05)；大鼠肝脏纤维化程度分级指数(0.69±0.31)较模型组(1.76±0.84)也显著下降，差异有统计学意义(P＜0.05)；同时PPARα的mRNA表达较模型组显著上升[(1.875±0.187)vs(1.429±0.132)]，而NF-κB的mRNA表达则显著下降[(0.983±0.089)vs(1.139±0.079)]，差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论自拟活血化瘀方能明显延缓实验性脂肪肝大鼠的进展，其机制可能与抑制HIF-1α信号有关。

活血化瘀汤；缺氧诱导因子-1α；非酒精性脂肪肝；进展

非酒精性脂肪肝病(nonacoholic fatty liver disease,NAFLD)的发病率日益升高，目前已成为严重危害人们的健康疾病之一[1]，主要表现为肝细胞脂肪变性和脂肪沉积，临床过程主要包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纤维化以及肝硬化。肝细胞中缺氧会导致缺氧诱导因子HIF表达上升，进一步加剧肝损伤[2]，相关研究在酒精性脂肪肝研究中已经证实，但在非酒精性脂肪肝中研究尚少。肝细胞中的脂肪沉积会使肝细胞肿胀，并进一步导致肝细胞缺氧，从而加重脂肪肝的进展。本研究笔者拟探讨自拟活血化瘀汤能否通过抑制HIF-1α信号并延缓非酒精性脂肪肝进展。

1 材料与方法

1.1 中药活血化瘀方组成 桃仁20 g，红花20 g，郁金20 g，川芎15 g，当归15 g，白芍12 g，三棱10 g，牡丹皮10 g，枳壳12 g。水煎制成汤剂。

1.2 造模及分组 实验用48只SD大鼠均购自南通大学动物实验中心。在饲养1周后用随机分层抽样法分为正常组(8只)、模型组(肌注生理盐水干预，8只)与处理组(32只，活血化瘀方汤剂灌胃)。正常组给予基础饲料,模型组给予高脂饮食(配方为：基础饲料87.8%、胆固醇2%、胆盐0.2%、猪油10%)。处理组在高脂饮食的基础上，每日两次给予活血化瘀方汤剂灌胃，模型组予以等量生理盐水灌胃。正常组及模型组在实验第12周，以氯胺酮麻醉大鼠后进行静脉采血，并切取肝脏右叶约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小组织放置于甲醛固定液中，再进行石蜡切片,剩余肝脏组织储存于液氮罐中保存备用。处理组分别在干预后第4周、第8周、第12周、第16周按随机抽样法分别处理8只大鼠，并留取血清及肝组织标本。

1.3 组织病理观察 将肝组织行HE染色后在显微镜下观察。肝组织脂肪变程度(F)按低倍镜下视野内脂肪变肝细胞占全部肝细胞的范围分级(F0～3)：F0，无脂肪变；Fl，33%以下肝细胞脂肪变；F2，33%～66%肝细胞脂肪变；F3，66%以上肝细胞脂肪变。

1.4 肝细胞炎症分级和纤维化程度观察 参照改良的Brunt标准[8]。炎症程度分为0～3级：0级为正常；1级表现为腺泡呈现少数气球样，散在个别点灶状坏死；2级表现为腺泡明显气球样肝细胞，腺泡内点灶状坏死增多，门管区轻、中度炎症；3级表现为腺泡广泛气球样肝细胞，腺泡内点灶状坏死明显，门脉管区轻、中度炎症伴(或不伴)门脉管区周围出现炎症。纤维化程度分期分为0～4期：0期，正常；1期为少量的细胞周围或窦周纤维化，2期为局灶或广泛的门静脉周围纤维化，3期表现为局灶或广泛的桥接纤维化，4期为肝硬化表现。

1.5 血清指标测定 将留取血液标本进行10 min离心，取上清后通过运用自动生化学分析仪进行检测，指标包括天门冬氨酸转氨酶(aspartate transaminase，AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、三酰甘油(triglyceride，TG)、胆固醇(cholesterol，CHOL)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、血糖(glucose，GLU)[3]。

1.6 检测不同组大鼠肝组织中HIF-1α、PPARα、NF-κB mRNA表达 运用TRIzol法提取肝脏组织中总RNA。在将RNA逆转录为cDNA后配制反应体系，置入7900HT荧光定量PCR仪中进行PCR扩增和荧光定量(扩增条件为：95℃1 min；95℃15 s，60℃60 s，40个循环；再60℃15 s，最后95℃15 s)。荧光定量数据分析采用参照基因的△Ct法计算每个样本目的基因的表达值(△Ct值表示基因反应产物的荧光值达到设定的域值时的反应循环数)。

1.7 统计学方法 应用SPSS16.0统计学软件进行数据分析，计数资料用整数表示，计量资料以均数±标准差(±s)表示，两两比较采用t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠非酒精性脂肪肝模型建立及结果 正常大鼠肝组织细胞形态规则、结构完整；高脂饮食喂养大鼠后第4周、第8周、第12周可分别形成轻度、中度、重度脂肪肝，喂养第16周后形成明显脂肪性肝炎；在自拟活血化瘀方治疗组，各时间点大鼠肝组织脂肪变性程度较模型组明显减轻，炎性细胞浸润及坏死灶明显减少。在连续给予活血化瘀汤灌胃8周后，大鼠肝脏脂肪变较模型组亦明显减轻，差异有统计学意义(t=9.58，P＜0.05)，炎症程度也明显好转，差异有统计学意义(t=8.79，P＜0.05)；活血化瘀汤灌胃12周后大鼠肝脏纤维化程度较模型组也显著下降(t=7.86，P＜0.05)，见表1。

表1 各组大鼠脂肪变性程度分级、炎症分级及纤维化分期(±s)

表1 各组大鼠脂肪变性程度分级、炎症分级及纤维化分期(±s)

注：与模型组比较，aP＜0.05。

组别模型组16周3.00±0.00 3.00±0.00 2.45±0.59 3.00±0.00 2.17±0.24a2.05±0.43a0 0 4周1.24±0.34处理组变性脂肪变炎症纤维化脂肪变炎症纤维化1.13±0.25 0 0 8周2.28±0.34 1.36±0.44 0 1.58±0.14a0.69±0.38a0 12周3.00±0.00 2.50±0.24 1.76±0.84 2.16±0.17a1.39±0.29a0.69±0.31a

2.2 不同组大鼠脂肪肝组织中HIF-1α、PPARα、NF-κB的mRNA表达差异 运用Realtime-PCR检测肝脏组织中HIF-1α、PPARα、NF-κB的mRNA表达水平(引物序列见表2)。在给予自拟活血化瘀汤灌胃干预4周后，大鼠肝脏中HIF-1α mRNA表达抑制并不明显，而在连续灌胃给药8周后，HIF-1α mRNA表达得到显著抑制，差异有统计学意义(t=9.38，P＜0.05)；在连续给药12周及16周后，NF-κB mRNA的表达则显著下降(t=8.82，P＜0.05；t=7.93，P＜0.05)，而PPARα mRNA的表达显著上升，差异均有统计学意义(t=7.87，P＜0.05；t=10.16，P＜0.05)，见图1。

表2 荧光定量PCR引物序列表

图1 HIF-1α、PPARα、NF-κB在不同程度脂肪肝组织中的mRNA表达

2.3 不同程度脂肪肝大鼠的肝功能及血脂、血糖水平 与模型组相比，活血化瘀汤治疗组在连续给药12周后，大鼠血清ALT、TG水平明显下降(t=8.89、9.98，P＜0.05)；但GLU、HDL-C及CHOL较模型组差异无统计学意义，药物干预没有明显改善作用，见表3。

表3 不同组各时间点大鼠肝功能及血脂水平(±s)

表3 不同组各时间点大鼠肝功能及血脂水平(±s)

注：与模型组比较，aP＜0.05。

组别正常组模型组CHOL(mmol/L) 0.39±0.18 0.44±0.19 0.48±0.27 2.61±0.87 2.89±0.69 0.46±0.19 0.38±0.16 2.49±0.67 2.68±0.35时间治疗组4周8周12周16周4周8周12周16周ALT(U/L) 73.50±11.25 93.50±10.65 92.00±19.06 103.17±18.76 92.13±20.18 77.00±14.13 106.50±18.98 75.17±20.54a58.50±19.87aGLU(mmol/L) 8.50±1.24 8.90±1.35 8.59±2.01 9.20±3.35 9.52±1.54 9.09±1.37 8.12±2.01 8.55±1.84 10.16±2.18 TG(mmol/L) 0.75±0.59 0.94±0.51 0.67±0.38 1.11±0.18 1.66±0.32 0.78±0.15 0.63±0.37 0.59±0.29a0.83±0.61aHDL-C(mmol/L) 2.15±0.29 2.4±1.02 2.00±0.68 0.61±0.18a0.56±0.25a2.25±0.65 1.77±0.76 0.65±0.36 0.49±0.39

3 讨 论

NAFLD与肥胖、高血脂、糖尿病等多种代谢性疾病密切相关，长期的NAFLD可引起肝纤维化甚至肝硬化，从而产生严重并发症。在NAFLD疾病演变过程中，肝细胞在脂肪沉积后导致肝细胞肿胀，并会进一步引起肝窦变形及微循环障碍，血流变慢，从而导致肝细胞缺血缺氧[4]，更易在氧化应激状态下发生脂质过氧化，导致肝细胞的进一步损伤。在酒精性脂肪肝中研究表明，缺氧会诱导肝细胞HIF-1α表达上调，并参与调控下游基因，进一步促进NAFLD进展为脂肪性肝炎、肝纤维化甚至肝硬化[5]。

中医观点认为，NAFLD与外感湿热疫毒、饮食不节、情志失调等关系非常密切。肝郁脾虚是NAFLD早期的主要病机，长时间缺乏运动、饮食失调等均会导致脾胃内伤，脾失健运，水湿内停，聚生痰浊，痰、瘀则与肝纤维化的进展关系密切。NAFLD早期多表现为肝郁脾虚，而后期血瘀证愈加突出[6]。随着疾病进展，NAFLD会产生湿浊内阻，气滞血瘀，痰瘀互结于肝而导致痹阻脉络，引起肝纤维化甚至肝硬化。

中医活血祛瘀疗法是改善机体缺血缺氧并促进血液循环的有效方法，但在治疗NAFLD中研究尚少，机制也尚不明确。本活血化瘀方剂中三棱、川芎、自芍、郁金、桃仁、红花均为活血祛瘀之药。川芎为血中气药，活血之力强。当归补血活血，自芍具有敛阴、解痉缓急止痛功效；三棱破血行气，配合枳壳理气；牡丹皮泻血中伏火，散热壅血瘀；栀子清气分之热。本方药物具有改善血液动力、降低血液粘聚，改善肝脏血液微循环的功效[7]。本研究结果表明，在连续给予活血化瘀汤4周时，大鼠脂肪肝的严重程度并未有明显减轻，但在连续给药8周后，脂肪肝程度明显减轻。同时在给药12周后，脂肪性肝炎及纤维化程度也得到明显抑制，同时AST、TG也有显著好转。

本研究发现，在应用活血化瘀方第8周，大鼠肝脏中HIF-1α表达亦显著下降，到第12周后，PPARα的表达的表达显著上升，同时NF-κB表达显著下降。NF-κB可调节多种炎症因子，如TNFα、IL-1、IL-6，单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)等，导致肝细胞炎症发生，并参与脂肪性肝炎的形成[8]。NF-κB信号与肝纤维化关系密切，可诱导肝细胞纤维化相关的因子如转化生长因子β1、基质金属蛋白酶-2、纤溶酶原激活物抑制因子-1等表达明显上升，从而促进胶原沉积及新生血管形成，导致肝纤维化的发生[8]。因此，本研究中自拟的活血化瘀方能抑制NAFLD进展，其机制可能与抑制HIF-1α的表达，并通过上调PPARα表达从而下调NF-κB信号，减少脂肪性肝炎、肝纤维化的发生。

总之，HIF-1α信号在NAFLD进展中起着重要作用，并且与PPARα/NF-κB信号有关。活血化瘀方能抑制HIF-1α能延缓NAFLD的进展，减少NASH及肝纤维化的发生。

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Effect of huoxue huayu tang on the progress of NAFLD targeting on HIF-1α in rats.

JIAO Jian-hua,CHEN Hai-jiao,SUN Yi-yan,SHEN Wei-dong,Department of Gastroenterology,the Affiliated Jiangyin Hospital of Medical College of Southeast University,Wuxi 214400,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo observe the effect of huoxue huayu tang on the progress of nonalcoholic fatty liver disease(NAFLD)targeting on hypoxia-induced factor 1α(HIF-1α)in rats.MethodsA total of 48 rats were randomly divided into the normal group(n=8),model group(n=8)and treatment group(n=32)according to random stratified sam-pling method.The rats in the normal group were fed with normal basic diet,and the rats in model group and treatment group were fed with high fat diet to establish the rat model of fatty liver.The rats of the treatment group were treated with huoxue huayu tang,and the rats of the model group were treated with the same amount of normal saline,with intragastric administration twice a day.The serum and liver tissues were collected from the normal group and the model group at the 16thweek of the experiment for blood lipids,liver function test and histopathological examination.In the treatment group,specimens of serum and liver tissue of 8 rats,which were randomly selected according to random sampling method,were respectively collected at the 4thweek,8thweek,12thweek and 16thweek after the intervention for further test.The serum biochemical parameters and fiver histological examinations were observed,and the HIF-1α,nuclear factor-κB(NF-κB)and peroxisome proliferator-activated receptor-α(PPARα)mRNA of liver tissue were detected with Realtime-PCR.ResultsThere was no hepatic steatosis and fibrosis in the normal group.After 8 weeks of intervention,the liver steatosis index and inflammation grade index of the treatment group were(1.58±0.14)and(0.69±0.38), which were significantly improved compared with(2.28±0.34)and(1.36±0.44)of the model group(P＜0.05).The expression of HIF-1α in the treatment group was(0.892±0.068),which was significantly inhibited compared with (1.413±0.139)in the model group(P＜0.05).After 12 weeks of intervention,the levels of alanine aminotransferase (ALT)and triglyceride(TG)in the treatment group were(75.17±20.54)U/L and(0.59±0.29)mmol/L,which were significantly decreased compared with(103.17±18.76)U/L and(1.11±0.18)mmol/L in the model group(P＜0.05).The degree of fibrosis was(0.69±0.31),which also significantly decreased compared with(1.76±0.84)in model group(P＜0.05).The PPAR-α mRNA expression in the treatment group was(1.875±0.187),which was significantly higher than (1.413±0.139)in the model group(P＜0.05),and the NF-κB mRNA expression in treatment group was(0.983±0.089), which was significantly lower than(1.139±0.079)in model group(P＜0.05).ConclusionThese results indicate that huoxue huayu tang can effectively delay the progression of NAFLD in rats,and the mechanism may be related to inhibition of HIF-1α signaling.

Huoxue huayu tang;Hypoxia-induced factor 1 α(HIF-1 α);Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD);Progress

R-332

A

1003—6350（2016）23—3813—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.23.009

2016-05-23)

中国肝炎防治基金会-天晴肝病研究基金资助课题(编号：cfhpc20132026)；江苏省无锡市科技计划项目(编号：CSZ00N1249)

焦建华。E-mail：jjhjyjs@163.com