张富军 姬传磊 李靖

大段异体骨移植钻孔携带抗生素骨水泥释放抗生素的效果研究*

张富军 姬传磊 李靖*

目的 观察大段异体骨移植钻孔携带抗生素骨水泥释放抗生素特性可行性及浓度。方法 取24只大白兔随机抽签法分为 A、B、C、D组，每组6只建立兔胫骨骨缺损模型，将异体骨分别用直径1.2、1.5、1.8、2.0mm钻头钻24个骨孔，并测量异体骨的表面积和孔的内表面积，用40 g骨水泥固相与液相混合后加入2 g万古霉素粉剂，分别填塞至异体骨的钻孔内，植入兔骨缺损处固定，在术后1、3、7、14、21、30天用注射器抽取0.3 mL生理盐水并通过放置的引流管进行冲洗，所得冲洗液用高效液相色谱仪测出的抗生素浓度。并求出异体骨的表面积与相应抗生素骨水泥的表面积的比值。结果4组抗生素在兔体内持续平均释放时间在30天以上，A组抗生素提洗量在30天低于最小抑菌浓度，该异体骨的表面积与相应抗生素骨水泥的表面积的比值为5.8∶1，B组接近最小抑菌浓度，该异体骨的表面积与相应抗生素骨水泥的表面积的比值为4.2∶1，C,D组的洗提量高于最小抑菌浓度差异有显著性意义（＜0.05），该异体骨的表面积与相应抗生素骨水泥的表面积的比值分别为3.2∶1和2.7∶1。结论大段异体骨移植钻孔携带抗生素骨水泥抗生素析出释放，在实验的30天中，异体骨表面积与相应抗生素骨水泥表面积的比值为为1∶3.2和1∶2.7时，万古霉素的释放量始终维持在高于有效的抗菌浓度。

骨缺损；异体骨；骨水泥；万古霉素

在临床上由于创伤、战时火器伤等所致的大段骨缺损并不少见，目前采用的治疗方法主要为同种异体骨段移植和带血管自体骨移植[1]，大段骨缺损常常合并严重的感染，治疗上较为棘手，不合理的治疗方法很容易使病情进展为感染性骨不连。抗生素局部缓释系统不但能作为骨替代材料可以修复骨缺损外，还能在创口局部持续释放较高高浓度的抗生素，从而发挥其强大的局部抗感染作用，在治疗骨折感染骨缺损拥有潜在的广阔临床应用前景[2]。采用同种异体骨段移植和带血管自体骨移植手术时，由于移植骨占位不利于抗生素骨水泥的放置，选择一种合适的抗生素骨水泥放置方法成为了该手术成功的必要条件。实验选择了同种异体骨钻孔携带抗生素骨水泥，通过对4种直径孔在体内携带抗生素骨水泥释放特点的比较，为大段骨缺损采用同种异体骨段移植和带血管自体骨移植的临床应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

随机选取新西兰大白兔24只，4月龄体重约3～3.5kg，雌雄性不限，购自第四军医大学动物实验中心。指骨钢板、螺丝钉、电钻、不同直径克氏针、摆锯、磨钻（强生辛迪斯），骨水泥（强生公司），万古霉素（浙江海正药业公司），直径2mm引流管（苏州伟康公司），岛津LC-10AD型高效液相色谱仪（第四军医大学骨科实验室），VP-ODS C18色谱柱（迪马公司），TL-9900色谱工作站（北京泰立公司），该实验在第四军医大学外科实验中心完成。

1.2 材料制备

将取下的1.5cm长兔胫骨骨段，实验组用直径1.2、1.5、1.8、2.0mm克氏针各钻孔24个，钻孔将该侧皮质钻透通髓腔。分别测量计算出异体骨的表面积和孔的内表面积，将40g骨水泥固体相和液体相混合，加入2g万古霉素搅拌成糊状，填塞至钻好的骨孔内（图1，彩图见插页）。

1.3 动物模型建立

取实验用兔，称体重量，于兔耳缘静脉注射2%戊巴比妥2mL/kg进行全身麻醉，术中必要时可进行兔耳缘静脉追加确保良好的麻醉状态，兔仰卧位四肢伸展，右腿部去毛，采用0.5%碘伏消毒，铺无菌手术单。在胫骨前外侧处做一弧形切口长约3cm，切开皮肤、皮下组织及深筋膜，显露胫骨远近端外侧。用摆锯分别在胫骨近端及远端截骨，制造1.5cm长之胫骨骨缺损，在胫骨近端靠近骨缺损端由皮质向髓腔钻孔，由该孔引入细引流管一根，引流管头端剪多个侧孔，将制备好的携带抗生素骨水泥同种异体骨段移植到骨缺损处，将引流管放置在异体骨髓腔，并用10孔钢板固定（图2，彩图见插页）。最后缝合手术切口，对照组将抗生素骨水泥栓放置在异体骨髓腔内固定，在胫骨近端靠近骨缺损端由皮质向髓腔钻孔，由该孔引入细引流管一根放入髓腔内。

1.4 检测指标

在术后1、3、7、14、21、30天分别用注射器抽取0.3mL生理盐水，通过放置的引流管进行冲洗，冲洗所得的液体液用高效液相色谱仪测出所含的抗生素浓度，即为每个样品在每一时段的抗生素浓度，即洗提速率（mg/L），并以此来计算每组的平均洗提率和标准差。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 实验动物数量分析

共纳入24只大白兔，所有动物均耐受手术，无局部感染、无死亡及其他并发症。引流管通畅无污染、无脱落，所有移植骨与宿主骨均骨性愈合，无延迟愈合或不愈合。

2.2 抗生素在动物体内洗提实验结果

各时间点及各组冲洗液测量结果见表1。由表1所得的抗生素释放曲线（见图3，彩图见插页）显示，起初术后第1天出现一个明显的释放高峰，术后第1天万古霉素的释放量最高，之后4组抗生素的释放均逐渐减少呈缓慢释放状态，4组抗生素在兔体内持续平均释放时间在30天以上，A组抗生素提洗量在21天即接近最小抑菌浓度，在30天低于最小抑菌浓度，该异体骨的表面积与相应抗生素骨水泥的表面积的比值为5.8∶1，B组在30天接近最小抑菌浓度，该异体骨的表面积与相应抗生素骨水泥的表面积的比值为4.2∶1，C,D组的洗提量均远高于最小抑菌浓度差异有显著性意义（＜0.05），该异体骨的表面积与相应抗生素骨水泥的表面积的比值分别为3.2∶1和2.7∶1。

表1 各时间点各组冲洗液中万古霉素浓度（±s，mg/L）

表1 各时间点各组冲洗液中万古霉素浓度（±s，mg/L）

术后时间（天） A组 B组 C组 D组1694.79±11.83949.94±16.171237.63±21.071447.52±24.64 676.26±40.57 7 3 324.60±19.47 137.16±15.82 443.80±26.63 578.20±34.69 244.33±28.18285.77±32.96 14 21 19.00±4.47 36.93±7.97 187.54±21.63 50.49±10.89 25.99±6.12 65.79±14.19 76.94±16.60 39.60±9.32 33.86±7.97 301.46±0.18 3.84±0.98 11.51±3.88 13.46±4.54

图3 各组万古霉素释放曲线

3 讨论

目前对于骨缺损治疗方法主要有自体骨移植、同种异体骨灭活后移植、生物医用材料（人工骨）填充骨缺损。其中自体骨移植被认为是修复骨缺损的“金标准”，抗生素骨水泥联合自体骨移植、治疗骨缺损可控制感染的发生，促进骨折愈合，恢复关节功能[3]。但是由自体骨提供的植骨量有限，无法提供功能与结构均相同的长段骨，且后期有植骨块骨折、骨吸收等问题。同种异体骨可补充这些的缺陷，大段同种异体骨移植则不受形状与数量的限制，可达到即时的骨量要求，其骨愈合过程与传统的长段自体移植骨类似，但大段异体骨经过了多种灭菌处理过程缺乏自身成骨作用，所以骨愈合过程缓慢，骨吸收严重骨不愈合率高及远期效果不理想。单纯长段异体骨移植最终结局往往失败，带血管的自体骨移植包含有成骨活性的骨细胞，有丰富的血供，其愈合过程由爬行替代可转化为一般的骨折愈合过程，其成功率较高可一期修复骨缺损，但数量极其有限、结构局限不能早期负重[4]。长段异体骨结合自体带血管骨移植修复四肢大段骨缺损，保存了大段异体骨的物理强度，并且可提供丰富血供加速异体骨活化促进骨愈合，较好地解决长段骨缺损修复的难题[5]，大段骨缺损合并感染的患者，因骨缺损所造成的残腔内含有大量的致病菌，不论应用何种方法清创都无法保证骨缺残腔内没有致病菌，故植入异体骨还是自体骨均有极大失败的可能性[6]，而植入抗生素骨水泥可有效的控制感染[7]。长段异体骨结合自体带血管骨移植修复四肢大段骨缺损由于移植骨的占位，无法放置抗生素骨水泥，本实验采用对大段异体骨钻孔来携带抗生素骨水泥，成功将抗生素骨水泥放置到了骨孔中，避免了骨水泥放置在异体骨周围而占位，并且无需二期取出骨水泥。钻孔的方法具有简单、迅速、不易医源性骨折等优点。

本实验观察了4种钻孔放置万古霉素骨水泥的方法，该方法在兔骨局部均能有效的释放出万古霉素，该方法万古霉素骨水泥的释药规律基本符合Higuchi方程，即抗生素释放速率与时间的平方根呈正比（洗提速率随时间呈指数样递减趋势）。由于手术创伤、周围软组织的破坏和死骨及残腔的形成，病变局部对抗细菌的能力大大降低，使得细菌在病变局部大量繁殖，进一步加重感染。由于细菌生物被膜的生成，所以在局部应用抗生素，要想得到很理想的抗菌效果，从抗生素骨水泥中释放出的抗生素浓度也必须远高于最小抑菌浓度（Minimuminhibitory concentration,MIC）。起初术后第1天出现一个释放高峰，4组术后第1天万古霉素的释放量最，均高远高于最小抑菌浓度。A组抗生素提洗量在21天即接近最小抑菌浓度，在30天低于等于最小抑菌浓度，该异体骨的表面积与相应抗生素骨水泥的表面积的比值为1∶5.8，B组在30天稍高于最小抑菌浓度，该异体骨的表面积与相应抗生素骨水泥的表面积的比值为1∶4.2，C,D组的洗提量均远高于最小抑菌浓度，第30天 C,D组释放的万古霉素为11.51mg/L和13.46mg/L，远大于2～4mg/L的万古霉素 MIC90[8]。异体骨表面积与相应抗生素骨水泥表面积的比值为为1∶2.2和1∶1.8。由此可见在实验的30天中C,D组万古霉素的释放量始终维持在较高的有效抗菌浓度，其二者抗菌效果相当。研究表明抗生素的释放随着骨水泥的表面积增加而增加[9]，C,D组钻孔抗携带生素骨水泥的表面积约为257.4mm2和301.6 mm2。由此可知当异体骨表面积与相应抗生素骨水泥表面积的比值为为1∶2.2和1∶1.8时即可达到有效的抗菌浓度。开始的万古霉素大剂量释放可能是由于局部高渗透压、高浓度所引起，能确保控制早期无细菌感染，之后的万古霉素释放变缓可能是由于局部环境中万古霉素的饱和状态[10]。抗生素骨水泥缓释系统在治疗骨髓炎的过程中，局部较高的抗生素浓度以及稳定持续的抗生素释放量，早期能有效的杀灭细菌后期可以防止耐药菌株的出现，明显提高治愈率。从骨水泥中释放抗生素其主要机制是：抗生素的浓度梯度、抗生素小分子、骨水泥有较大孔隙等特性，抗生素从骨水泥内部到表面弥散和顺浓度的扩散。有学者认为抗生素骨水泥中抗生素的释放浓度随时间推移而逐渐降低，故骨水泥抗生素的含量越高，抗生素越容易释放[11-13]。

上个世纪70年代初以来 PMMA-庆大霉素链珠临床应用获得成功[14]，在局部使用抗生素骨水泥用来防治骨与关节感染得到了广泛认同，一期病灶彻底清除、髓腔或者局部植入万古霉素骨水泥、结合使用全身敏感抗生素，在治疗创伤性骨髓炎方面可获得较好的临床效果[15]。耐药菌的不断出现使抗生素的合理选择成为这项技术的焦点。据报道，创面感染的耐甲氧西林葡萄球菌检出比例占金黄色葡萄球菌41.18%[16]。万古霉素能够抑制细菌细胞壁蛋白合成，可以抑制细菌在界面组织内粘附，阻止细菌在假体周围形成蛋白被膜，在局部应用有较高的杀菌浓度，局部杀伤力强，性能稳定，其对多数革兰氏阳性杆菌和球菌均有杀灭效果，于对有显著耐药性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有100%的杀菌作用[15]。有报道每40g骨水泥中可用到2g万古霉素不会影响骨水泥的强度[17]。魏波等[18]报在骨水泥液相与固相混合后再加入抗生素的混合方法更有利于抗生素的释出。本实验采用上述的方法制备抗生素骨水泥取得了良好的释放效果。万古霉素是低毒副作用安全的抗生素，也是非常有效的抗菌素，这是本次研究选择万古霉素的主要原因。

综上所述，实验中4组抗生素在兔体内持续平均释放时间在30天以上，C,D组30天洗提量均远高于最小抑菌浓度，该异体骨的表面积与相应抗生素骨水泥的表面积的比值分别为1∶2.2和1∶1.8。由此可知当异体骨表面积与相应抗生素骨水泥表面积的比值达到1∶2.2时即可产生有效的抗菌浓度。该方法具有局部抗菌效果肯定、简单、迅速、不占据髓腔等优点，有利于采用同种异体骨段移植和带血管自体骨移植手术。

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The concentration of vancomycin released from antibotic bone cement carried by drilled massive bone allograft in a rabbit model

Zhang Fujun,Ji Chuanlei,Li Jing.
Department of Orthopaedics,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University, Xian Shanxi,710032,China

Objective To measure the concentration of vancomycin released from vancomycin-composited bone cement carried by massive bone allograft and verify its feasibility in a rabbit model.Methods Twenty-four white rabbits were used to establish tibia defect model.These rabbits were randomly divided into four groups：group A,group B,group C and group D.Bone allografts were made from cryopreserved rabbit tibia and uniformly drilled twenty-four holes out of its cortex.The diameter of these holes was 1.2,1.5,1.8 and 2.0mm for group A,B,C and D,respectively.Vancomycin bone cement wasmadebyadding2gvancomycinpowdersinto40gmixtureofsolidphaseandliquidphaseofbonecement.Ineachgroup, bone allografts carried with different volume of vancomycin bone cements were implanted into the tibia defects and fixed. The superficial area ratio of bone allograft to bone cement in each group was calculated.The concentration of vancomycin intheflushingfluidacquiredat 1,3,7,14,21and30 dayspost-operation was measuredbyMPLC.Results The average releasetime ofvancomycinbone cement in fourgroups was greater than30 days.The superficialarearatioof boneallografts to bone cements was 5.8∶1,4.2∶1,3.2∶1 and 2.7∶1 for group A,B,C and D,respectively.The elution volume of vancomycin in group A was less than its minimal inhibitory concentration(MIC).In group B,vancomycin elution volume wasclosedtoMIC.IngroupCandD,vancomycinelutionvolumewashigherthanMIC(＜0.05).ConclusionVancomycin bone cement carried by drilled massive bone allograft can release vancomycin during 30 days after implantation.The preferable superficial area ratio of bone allograft to bone cement is 3.2∶1 and 2.7∶1.

Bone defect;Bone allograft;Bone cement;Vancomycin

R683

A

10.3969/j.issn.1672-5972.2016.04.002

swgk2016-04-0078

张富军（1972-）男，在读博士，副主任医师。研究方向：人工关节置换。

[作者简介]姬传磊（1981-）男，硕士，主治医师。研究方向：骨肿瘤。

2016-04-14）

中国人民解放军总后科研项目（项目编号：13CXZ054）

第四军医大学西京医院骨科，陕西西安710032

*[通讯作者]李靖（1973-）男，博士，副主任医师。研究方向：骨肿瘤。

张富军、姬传磊为本文共同第一作者。