吴文特，刘彬，杨巧，阳海清

(南华大学附属第一医院骨外科，湖南 衡阳 421001)

·论 著·

DADS对人骨肉瘤细胞U-20S生物学活性的影响

吴文特，刘彬，杨巧，阳海清

(南华大学附属第一医院骨外科，湖南 衡阳 421001)

目的 探讨二烯丙基二硫(DADS)对人骨肉瘤细胞U-20S生物学活性的影响。方法将人骨肉瘤U-20S细胞随机分为DADS处理组与空白组，DADS处理组又分为15 mg/L、30 mg/L、60 mg/L、120 mg/L 4个不同浓度小组，每组分别作用于U-20S细胞24 h、48 h、72 h后进行相关检测，每组实验重复3次。采用MTT比色法测量不同的吸光值以检测DADS对人骨肉瘤细胞U-20S的抑制作用；Annexin V-FITC/PI染色法及流式细胞术检测骨肉瘤细胞凋亡率及细胞周期变化情况；Transwell侵袭实验通过计量同一视野下细胞数量以检测细胞侵袭能力；细胞划痕实验检测细胞迁移能力。结果MTT比色法结果显示，浓度为60 mg/L DADS处理组作用于U-20S细胞24 h后其吸光值比对照组低(P＜0.05)。随着浓度的增加，DADS对骨肉瘤细胞抑制作用无明显增强，表明DADS对骨肉瘤细胞有抑制作用，但并不呈剂量-效应依赖关系；染色法及流式细胞术结果显示，60 mg/L DADS作用于U-20S细胞24 h凋亡率为15.89%，高于空白组细胞的8.65%；60 mg/L DADS作用于U-20S细胞24 h，G2/M期的细胞为10.44%，高于空白组G2/M期的细胞8.18%(P＜0.05)；侵袭试验结果显示，DADS处理组细胞计数为(63±2)个，较空白组细胞计数(104±3)个显著减少(P＜0.05)，表明DADS处理组能抑制细胞侵袭能力；细胞划痕试验结果显示，60 mg/L DADS处理组细胞划痕之间的距离大于空白组，以作用48 h抑制作用最为显著(P＜0.05)，表明DADS(浓度为60 mg/L)能抑制U-20S细胞的迁移，并且随着时间的增加，48 h抑制作用更加显著。结论DADS能抑制骨肉瘤细胞株U-20S增殖，诱导细胞凋亡，抑制细胞的侵袭和转移。

二烯丙基二硫；骨肉瘤；凋亡；增殖；侵袭；转移

骨肉瘤是临床上最为常见的恶性骨肿瘤，主要发生于青少年患者，好发部位是长骨的干骺端，具有高度恶性、早期转移及病死率极高等特点[1-2]。未发生肿瘤转移的患者5年生存率为70%，而出现转移的患者5年生存率仅为20%左右[3-5]。对于生长在脊柱、颅底、骨盆等特殊部位的骨肉瘤患者以及肿瘤切除术后复发的患者，只能采用化疗作为姑息性治疗方法来延长患者的生存期[6-12]。

二烯丙基二硫(Diallyl disulfide，DADS)是大蒜中的一种脂溶性成分。近年来有研究报道DADS具有抗肿瘤侵袭和转移的作用[13-14]。本文采用人骨肉瘤U-20S细胞株，进行细胞体外实验，探讨DADS对人骨肉瘤U-20S细胞增殖、凋亡、细胞周期和迁移的影响，为以后DADS作为一种治疗骨肉瘤的新型化疗药物应用于临床提供理论和试验依据。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 DADS(Fluka公司)；Tween 80 (对照组，华美生物工程公司)；1640培养液(Hyclone)；胎牛血清(FBS，Gibco)；胰酶消化液(Hyclone)；青霉素-链霉素溶液 (碧云天)；MTT(Sigma)；Annexin V-FITC/PI双染色凋亡检测试剂盒。

1.2 实验器材 CO2培养箱：GOLD-SIM公司生产，型号：W200IR。超净工作台：成都市苏净科学器材有限公司生产，型号：SW-CJ-1F。光学显微镜：OLYMPUS公司生产。小型台式冷冻离心机：Thermo Scientific公司生产，型号：FRESCO17。普通高速离心机：上海安亭科学仪器厂，型号：TDL-5-A。立式超低温冰箱：日本三洋公司生产，型号：MDF U52V。普通冰箱：河南新飞电器有限公司生产，型号：BCD-252K。实验室超纯水器：Kertone Ltd公司生产，型号：P10-Y。高压灭菌锅：STIK(上海)公司生产，型号：MJ-54A。扫描仪：上海天能科技有限公司生产，型号：Ranon GIS-2008。制冰机：华美公司生产，型号：XUEKE。摇床：上海泽权仪器设备有限公司生产，型号：Enviro-Genie。恒温水浴槽：Pharmacia公司生产，型号：SY-1210。微量移液器：德国Eppendorf公司生产。多功能PCR仪：Applied Biosystems公司生产，型号：2720。

1.3 实验方法 将人骨肉瘤U-20S细胞随机分为DADS未处理组(空白组)和DADS处理组。DADS处理组又根据浓度不同分为15 mg/L、30 mg/L、60 mg/L、120 mg/L 4个不同浓度小组，分别作用于U-20S细胞24 h、48 h、72 h。

1.4 MTT比色法检测人骨肉瘤细胞U-20S的增殖能力 选取U-20S细胞培养于1640胎牛血清培养基中，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，当培养细胞密度达80%左右，使用胰酶消化细胞，一瓶分为二瓶，进行传代培养。取对数生长期的U-20S细胞，胰酶消化细胞，调整细胞密度约1×105个/mL。铺3个96孔板，分别标记为24 h、48 h、72 h，每板15个孔，每孔加入100µL细胞悬浮液，37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养过夜。取出3个96孔板，去除旧的培养基，分别对应加入已配制好的含DADS的培养基，每组设立3个复孔，37℃，5%CO2培养箱中继续培养，记录处理好的时间。待药物处理24 h后，取出对应96孔板，每孔加入20µL 5 mg/mL的MTT溶液，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中继续培养4 h后取出，吸去旧的培养基和MTT混合溶液，每孔加入150µL DMSO溶液，室温下缓慢摇晃10 min，490 nm处测定吸光度值并记录结果。采用同样的方式于对应时间处理48 h、72 h样品。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率 选取空白组、DADS(60 mg/L，处理24 h)两组，使用不含EDTA的胰酶消化收集两组细胞，使用PBS洗涤细胞两次，以每次2 000 r/min离心5 min，收集1～5×105个细胞，依次加入500µL的Binding buffer悬浮细胞、5µL Annexin V-FITC、5µL Propidium Iodide，混匀后置于室温、避光处，反应5～15 min，在流式细胞仪观察检测。

1.6 流式细胞仪检测细胞周期 选取空白组、DADS(60 mg/L，处理24 h)两组，U-20S细胞培养于含10%FBS的DMEM高糖培养基中，37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，每2～3 d换液一次，培养至细胞密度达80%左右，使用胰酶消化后使用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2～3次制成单细胞悬液，并调整细胞数量至1×106个/mL。选取1 mL预冷PBS重悬细胞加入离心管，800 r/min离心5 min，吸净上清后再加入400µL PBS液，轻轻重悬细胞，使细胞分离为单个，逐滴加入预冷的100%乙醇1.2 mL，使其终浓度为75%，放置于4℃环境下过夜固定。隔日取出固定的样品，800 r/min离心5 min，弃去上清后加入1 mL预冷的PBS重悬细胞，800 r/min离心5 min，离心收集细胞，去除乙醇后加入150µL PI(碘化丙啶)工作液，放置于温度为4℃环境中避光染色30 min后转至流式检测管进行检测。PI用488 nm氩离子激光器激发，由630 nm通滤光片接收，通过FSC/SSC散点图收集10 000个细胞，采用设门技术，排除粘连细胞和碎片，分析PI荧光直方图上各细胞周期的百分率。

1.7 Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力 (1)制备Transwell小室：冰上操作，吸取120µL Matrigel胶及无血清培养基240µL按1:2进行稀释，每个小室铺胶60µL，共制作成6个小室，置于37℃培养箱内60 min使胶凝固；(2)水化基底膜：吸出小室内残余液体，每个小室加入70µL无血清DMEM培养基，放置于37℃、30 min水化基底膜；(3)制备细胞悬液：将处理好的细胞用0.25%的胰酶进行消化后用无血清培养基制成细胞悬液，调整细胞密度为1×105个/mL，设置空白组和60 mg/L DADS处理组两组，处理24 h；(4)接种：吸取100µL液加入侵袭小室内，下室中加入含10%FBS的DMEM，培养24 h；(5)染色：弃去小室内培养液，用PBS洗两遍后用湿棉签擦尽上室面的细胞，丙酮:甲醇=1:1液，固定20 min后PBS洗涤两遍，0.1%结晶紫染色20 min后用清水洗涤3次以上；(6)细胞计数：电子显微镜下观察并记录实验结果。

1.8 细胞划痕实验检测细胞迁移能力 选取空白组和DADS两组，取1块无菌6孔板，用Marker笔在孔的背面每隔0.5 cm平均画出5道平行标记线，在孔中加入约含5×105个U-20S细胞的细胞液，待细胞贴壁后加入60 mg/L DADS液处理细胞24 h后再用枪头对比直尺划痕，PBS洗涤细胞3次后去除划下的细胞，加入低血清培养基(1%～2%的血清)，放入37℃，5%CO2培养箱中培养，按0 h、24 h、48 h时间点取样并标记。

1.9 统计学方法 应用SPSS19.0统计软件包进行数据分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示，采用t检验。检验水准为双侧α=0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT比色法检测人骨肉瘤细胞U-20S的增殖 表1和图1结果显示，与对照组比较，浓度为60 mg/L DADS处理组在作用细胞24 h其吸光值最低，对U-20S细胞具有显著的抑制作用(P＜0.05)。DADS在24 h对细胞有抑制作用，浓度为60 mg/L时抑制效果最佳，48 h和72 h的抑制效果不明显。表明DADS对骨肉瘤细胞有抑制作用，以浓度为60 mg/L，作用24 h对骨肉瘤细胞U-20S抑制作用最大，但并不呈剂量-效应依赖关系。

2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡流式细胞术实验结果 60 mg/L DADS作用于U-20S细胞24 h凋亡率为15.89%(UR=11.53%，LR=4.36%)，见图2，高于空白组细胞的8.65%(UR=3.02，LR=5.63)，见图3，表明DADS可以促进U-20S细胞的凋亡。

组别对照组DADS组浓度0 mg/L 15 mg/L 30 mg/L 60 mg/L 120 mg/L 24 h 0.460±0.008 0.649±0.052 0.575±0.124 0.417±0.031a0.488±0.093 48 h 0.719±0.021 0.770±0.044 0.722±0.071 0.723±0.039 0.551±0.017 72 h 0.888±0.051 0.861±0.026 0.850±0.074 0.837±0.032 0.709±0.008注：与对照组比较，aP＜0.05。

图1 DADS对U-20S细胞增殖的抑制作用

图2 空白组细胞凋亡情况

图3 DADS组细胞凋亡情况

2.3 流式细胞仪检测细胞周期流式细胞术方法检测 空白组G1/0期的细胞占总细胞的76.10%，荧光强度为79.15；G2/M期的细胞占总细胞的8.18%，荧光强度为146.43(见图4)；而DADS组G1/0期的细胞占总细胞的74.06%，荧光强度为89.90；G2/M期的细胞占总细胞的10.44%，荧光强度为166.32(见图5)。与空白组比较，浓度为60 mg/L DADS处理组的细胞周期分布发生了显著改变，处于G2/M期的细胞数目显著增多，且差异有统计学意义(t=2.562，P＜0.05)，表明DADS可阻滞U-20S细胞于G2/M期。

图4 空白组细胞周期情况

图5 DADS组细胞周期情况

2.4 Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力 通过电子显微镜计数，DADS组细胞计数为(63±2)个，空白组细胞计数为(104±3)个，两组比较，DADS处理组细胞较空白组显著减少，且差异有统计学意义(t= 3.153，P＜0.05)，表明DADS可以抑制U-20S细胞的侵袭能力。见图6和图7。

图6 空白组细胞计数(×400)

图7 DADS组细胞计数(×400)

2.5 划痕试验检测细胞迁移能力 划痕试验结果显示：DADS(浓度为60 mg/L)处理后细胞间的划痕距离较对照组大，表明DADS能抑制U-20S细胞的迁移，并且随着时间的增加抑制能力逐渐增强，作用48 h后抑制作用更加显著(P＜0.05，图8～图13)。在划痕每侧边缘随机选取30个点后取其中线代表划痕边缘，测量不同时间点划痕边缘的最小距离，计算划痕边缘之间的平均距离，比较空白组和DADS处理组不同时间点划痕之间的距离，表明60 mg/L DADS能抑制U-20S细胞的迁移，并且随着时间的增加，48 h抑制作用更加显著。见表2。

图8 空白组0 h细胞迁移情况(×400)

图9 空白组24 h细胞迁移情况(×400)

图10 空白组48 h细胞迁移情况(×400)

图11 DADS组0 h细胞迁移情况(×400)

图12 DADS组24 h细胞迁移情况(×400)

图13 DADS组48 h细胞迁移情况(×400)

表2 使用Image-Pro Plus软件测量图片中划痕之间的距离(±s，n=3)

表2 使用Image-Pro Plus软件测量图片中划痕之间的距离(±s，n=3)

组别空白组DADS组0 h 889.2±1.39 996.4±1.86 24 h 660.4±5.38 708.6±4.30 48 h 536.6±2.58 574.2±1.59

3 讨 论

骨肉瘤是临床上最为常见的原发性恶性骨肿瘤，具有恶性程度高、早期转移率高、病情进展迅速且病死率高等特点，其发病率呈上升趋势。

二烯丙基二硫(Diallyl disulfide，DADS)是大蒜素的主要成分，许多研究已证实DADS对胃癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、白血病、结肠癌等多种肿瘤的生长均有抑制作用，并且具有诱导肿瘤细胞凋亡、调节致癌物质代谢、抑制血管生成的作用[15-21]。对体内外的多种恶性肿瘤细胞及血液系统相关疾病，DADS均有抗增殖作用[21-26]。本实验研究了DADS对人人骨肉瘤细胞U-20S生物学活性的影响。结果显示，DADS能抑制骨肉瘤细胞株U-20S增殖，诱导细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。MTT试验显示：不同浓度的DADS对U-20S细胞增殖均有抑制作用，但同一浓度的DADS作用不同时间，对细胞增殖的抑制作用亦不相同。DADS对细胞增殖的抑制作用并不随着时间及浓度增加而增强，其中以15 mg/L的DADS作用24 h对细胞增殖抑制作用最小，60 mg/L的DADS作用24 h对细胞增殖抑制作用最大，可能与浓度增加及作用时间延长导致某些蛋白表达水平增高或降低相关凋亡细胞可被用于细胞活性鉴定的染料染色，而坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的被染色后可产生红色荧光，反之，细胞膜完整的细胞则不会出现红色荧光，基于这一特性，通过流式细胞术检测DADS处理组及空白组细胞凋亡率的结果显示：处理组细胞凋亡率明显大于对照组细胞的凋亡率，其中晚期凋亡细胞占主要部分流式细胞术测定细胞周期结果显示：DADS处理组G2/M期细胞百分率为10.44%，而空白对照组G2/M期细胞百分率为8.18%，DADS可将U-20S细胞阻滞在G2/M期，表明DADS抑制U-20S细胞增殖与G2/M期阻滞有密切关系，这可能是DADS抗肿瘤作用的机制之一，但其具体分子作用机制尚不清楚，有待于进一步的研究证实。细胞Transwell侵袭实验及划痕试验中，DADS能抑制U-20S细胞的转移和侵袭，这可能与上调或下调某些蛋白的表达水平有关，但其具体的分子通路及作用机制带有待进一步实验研究。

近些年来，新型的抗肿瘤药物不断涌现，其中大部分是来源于植物类。而新型的抗肿瘤药物不仅可以为我们提供更安全、更有效的治疗选择，亦能减少化疗药物的一部分副作用。DADS具有来源极其广泛、价格低廉等优点。本实验通过不同检查方法检测DADS对人骨肉瘤U-20S细胞的生物学活性影响，证实了DADS能诱导人骨肉瘤U-20S肿瘤细胞凋亡，抑制U-20S细胞的增殖、侵袭及转移，能够为临床上治疗骨肉瘤提供新的辅助方法，具有良好的前景。

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Effect of DADS on the biological activity of human osteosarcoma cell line U-20S.

WU Wen-te,LIU Bin,YANG Qiao, YANG Hai-qing.Department of Bone Surgery,the First Affiliated Hospital of University of South China,Hengyang 421001, Hunan,CHINA

ObjectiveTo explore the effect of DADS on the biological activity of human osteosarcoma cell line U-20S.MethodsThe cells of U-20S were randomly divided into DADS treatment group and the blank group. DADS treatment group was divided into 15 mg/L,30 mg/L,60 mg/L,120 mg/L four different concentration groups,and U-20S cells of each group were separately treated for 24 h,48 h,72 h.Then relative tests were performed.Each experiment was repeated 3 times.The inhibitory effect of DADS on human osteosarcoma cell line U-20S were detected by MTT colorimetric.The apoptosis rate and cell cycle changes of osteosarcoma cells were detected by Annexin V/PI technique and flow cytometry.The cell invasion ability was measured by Transwell testing.The metastasis of U-20S cells induced by DADS was analyzed by cell scratch experiment testing.ResultsThe results of MTT showed that the cell absorbance in 60 mg/L DADS treatment group after 24 hours was lower than that of blank group(P＜0.05).With the increase of concentration,the inhibitory effect of DADS on the osteosarcoma cells showed no obvious improvement, which indicated that DADS had inhibitory effect on human osteosarcoma cells,but not in a dose-dependent effect.Staining and flow cytometry results displayed that the cell apoptosis rate was 15.89%in 60 mg/L DADS treatment group after 24 h,which was higher than the cell apoptosis rate(8.65%)in blank group after 24 hours.The proportion of G2/M phase cells was 10.44%in DADS treatment group after 24 h,which was higher than that(8.18%)in blank group after 24 hours (P＜0.05).Invasive test results showed that the cell count for DADS treatment group was(63±2),which was less than (104±3)in blank group(P＜0.05).The results suggested that DADS treatment group can inhibit cell invasion ability.Cell scratch test results showed that the cell scratch distance in 60 mg/L DADS groups was greater than that in blank group, which showed that DADS(60 mg/L)could inhibit the migration of U-20S cells,and with the increase of time,the inhibitory effect reached the peak after 48 hours(P＜0.05).ConclusionDADS can inhibit the proliferation,induce cell apoptosis,and inhibit cell invasion and metastasis of osteosarcoma cell line U-20S.

Diallyl disulfide;Osteosarcoma;Apoptosis;Proliferation;Invasion;Metastasis

R738

A

1003—6350（2016）10—1549—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.10.001

2015-11-26)