沈盎绿，李道季

（1.中国水产科学研究院东海水产研究所，农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室，上海 200090；2.华东师范大学，河口海岸国家重点实验室，上海 200062）

不同营养盐水平对东海原甲藻和米氏凯伦藻生长的影响

沈盎绿1，2，李道季2

（1.中国水产科学研究院东海水产研究所，农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室，上海 200090；2.华东师范大学，河口海岸国家重点实验室，上海 200062）

为了阐明营养盐水平下对东海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）和米氏凯伦藻（Karenia mikimotoi）的生长特性，研究了不同营养盐总体浓度和磷限制对两种藻类生长的影响。结果表明，不同营养盐水平对东海原甲藻和米氏凯伦藻的生长影响显著，培养中期添加营养盐（二次添加）可以显著提高两种藻类的细胞浓度，同步测定氮磷营养盐水平发现，一次性添加营养盐培养时东海原甲藻对硝酸盐和磷酸盐吸收利用率分别为31.6%和76.9%，米氏凯伦藻对硝酸盐和磷酸盐的吸收利用率分别为92.5%和99.9%，二次添加营养盐培养时则稍低，同时两种藻类在实验后期较低磷酸盐水平的情况下仍然能维持较高细胞浓度，说明藻细胞内存在明显的营养盐库。在磷限制情况下，东海原甲藻和米氏凯伦藻的生长均受到明显的抑制，东海原甲藻细胞体积在磷限制培养下变化不大，而且米氏凯伦藻细胞体积在磷限制培养一段时间后明显增大，当磷酸盐恢复正常水平，细胞体积又快速恢复。该结果对于阐释不同营养盐水平下东海原甲藻和米氏凯伦藻的生长竞争机制具有一定的启示作用。

东海原甲藻；米氏凯伦藻；营养盐；生长

富营养化是东海赤潮高发区连续发生大规模赤潮的物质基础，对赤潮发生和演替起着关键性的作用，其中氮、磷是海洋浮游植物生长的限制因子。东海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）和米氏凯伦藻（Karenia mikimotoi）是东海赤潮高发区甲藻赤潮的主要优势种，近年来对有关营养盐与两种甲藻生长、生理生化等方面影响的报道颇多。之前的研究多集中在东海原甲藻和米氏凯伦藻对不同氮源或磷源的吸收利用［1－4］，东海原甲藻对各类无机氮（NO－3-N、NH＋4-N和NO－2-N）和有机氮（尿素）均能较好利用，对甘氨酸和L-丙氨酸利用率不高［4－5］，米氏凯伦藻对NaNO3和NaNO2的利用效率要高于NH4Cl，以NaNO3和NaNO2为氮源时该藻生长情况也较好［3］，而不能利用甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸和1，4-丁二胺盐酸盐［6］。东海原甲藻和米氏凯伦藻既可以直接吸收利用无机磷（NaH2PO4），又可以不同程度地利用有机磷（三磷酸腺苷二钠盐、D-葡萄糖-6-磷酸钠和甘油磷酸钠）［1，7－9］。不同氮磷浓度或者氮磷比对东海原甲藻和米氏凯伦藻生长的影响也非常显著［10－12］，氮磷比低于或高于Redfield比值（N/P＝16）时都会影响到东海原甲藻的生长速率［13］，而氮磷比80∶1时米氏凯伦藻生长速率最大［14］，另外，当氮源不同时，东海原甲藻生长速率达到最大值时的氮磷比也各不相同［5］。

在赤潮发生过程中，由于藻类生长需要各类营养元素，因此海水中各类营养盐浓度随着赤潮生消的进程同步减少，但是当赤潮优势种对某种营养元素需求特别大反而成为限制因素，比如中肋骨条藻（Skeletonema costatum）对磷的需求比较大，当海水中磷处于较低水平时中肋骨条藻赤潮就开始消亡［15］。因此，非常有必要对东海赤潮高发区常见甲藻赤潮优势种东海原甲藻和米氏凯伦藻在不同营养盐水平培养下的生长特性进行系统研究。

1 材料与方法

1.1 藻种来源与培养条件

东海原甲藻由国家海洋局第二海洋研究所（杭州）陆斗定教授提供，米氏凯伦藻由中国水产科学研究院东海水产研究所（上海）提供。藻类培养基采用f/2培养基［19］。培养基所用海水采自浙江省舟山市嵊山岛附近（30°45′N，122°50′E），海水pH为8.0，盐度为28，海水经过孔径为0.45μm滤膜过滤后备用。海水和培养基储备液通过121℃高压蒸汽灭菌20 min，在超净工作台配制所需培养基，所有培养基储备液、藻类培养等所需三角瓶等全部经过高压灭菌后使用。藻类培养温度为20±1℃，光照强度为65～70 μmol·m－2·s－1，光暗比为12 h∶12 h，所有实验光照强度和光暗比均为这个条件。藻类培养和实验均在多温度梯度光照培养箱中进行（MTI-201B，Rikakikai，Japan）。所有实验采用的藻类均为培养至指数生长期藻类。

1.2 实验方法

1.2.1 不同营养盐水平对两种藻类生长的影响实验

将处于指数生长期的东海原甲藻和米氏凯伦藻用于培养实验，东海原甲藻的起始浓度均为0.65×104cells·mL－1，米氏凯伦藻的起始浓度均为0.25×104cells·mL－1，培养条件与前面一致，不同营养盐水平设置为f/2培养基水平一次性添加后培养至实验结束（第33天）和在f/2培养基水平上在实验中期（第12天后）添加一次培养基母液。培养容器为100 mL三角瓶含50 mL藻液，每个处理重复3次，每天早晚固定时间手动摇动藻液2次，分别在第0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30天和33天取样0.45 mL藻液加0.05 mL鲁戈氏液固定，在光学显微镜（BX43，Olympus， Japan）下采用浮游植物计数框计数。同时同步测定和含量，测定方法参照海洋监测规范［20］。藻类比生长速率（μ，d－1）计算按照公式μ＝（lnN2-lnN1）/（t2－t1），其中N1为培养时间为t1时藻类细胞浓度，N2为培养时间为t2时藻类细胞浓度，实验测定营养盐添加之前（μ1）即t1与t2分别为第0天与第12天的数据和营养盐添加之后（μ2）t1与t2分别为第12天与细胞浓度最高值的所对应的时间，营养盐一次性添加（μ1′和μ2′）的实验在相同的时间测定生长速率。

1.2.2 磷限制对两种藻类生长的影响实验

将处于指数生长期的东海原甲藻和米氏凯伦藻用于培养实验，东海原甲藻的起始浓度均为0.45×104cells·mL－1，米氏凯伦藻的起始浓度均为0.25×104cells·mL－1，培养条件与前面一致，对照组正常营养盐水平设置为f/2培养基水平一次性添加后培养至实验结束（第18天），磷限制实验营养盐水平设置培养基为f/2（NaH2PO4·H2O除外）一次性添加后培养至实验结束（第18天），培养液中的磷酸盐仅为本底海水浓度，其中PO3－4浓度为0.032mg·L－1。培养容器为100 mL三角瓶含50 mL藻液，每个处理重复3次，每天早晚固定时间手动摇动藻液2次，分别在第0、3、6、9、12、15、18和24天取样0.45 mL藻液加0.05 mL鲁戈氏液固定，在光学显微镜（BX43，Olympus，Japan）下采用浮游植物计数框计数。并在第0、9、18和24天取样进行在显微镜下测量东海原甲藻和米氏凯伦藻体长和体宽，其中第24天取样后剩余藻类培养中添加f/2培养基配方中的NaH2PO4·H2O用于藻类恢复实验，共计6天，在实验结束时测量藻类体长和体宽。

1.3 数据处理

所有测定数据均为三个重复的平均值（mean）±标准差（SD）。不同营养盐水平之间的生长差异采用Student’st-test检验，其中P＜0.05：表示差异显著。磷限制对米氏凯伦藻细胞体积的影响实验结果在单因素方差分析（one-way ANOVA）的基础上，采用Duncan多重比较法检验不同温度处理间差异（P＜0.05）。所有数据处理利用PASW Statistics 18.0和Excel 2010软件。

2 结果与分析

2.1 不同营养盐水平对两种藻类生长的影响

由图1可知，东海原甲藻一开始就进入指数生长期，从第6天开始就进入生长稳定期并一直维持到第15天，而后开始东海原甲藻生长又进入一个上升期在第21天细胞浓度达到峰值，之后进入衰老期。从第18天到27天期间，第12天后添加营养盐的培养组中的东海原甲藻细胞浓度显著高于一次性添加营养盐的培养组（P＜0.05），在实验后期第30和33天期间不同营养盐水平培养组中东海原甲藻的生长又趋于一致。二次添加营养盐组在营养盐添加前后东海原甲藻的最大比生长速率分别为0.148 d－1和0.068 d－1，而一次性添加营养盐组在相同时间段东海原甲藻的最大比生长速率分别为0.148 d－1和0.034 d－1，其中添加营养盐后最大比生长速率显著高于一次性添加营养盐组（表1，P＜0.05）。米氏凯伦藻的生长趋势跟东海原甲类似，前15 d处于指数生长期，而稳定期较短（只有3～6 d左右），之后生长也进入一个上升期，在第24天细胞浓度达到峰值，之后进入衰老期。在之后的实验期间（第24天至33天），第12天后添加营养盐的培养组中米氏凯伦藻细胞浓度显著高于一次性添加营养盐的培养组（P＜0.05）。二次添加营养盐组在营养盐添加前后东海原甲藻的最大比生长速率分别为0.332 d－1和0.108 d－1，而一次性添加营养盐组在相同时间段东海原甲藻的最大比生长速率分别为0.343 d－1和0.069 d－1，其中添加营养盐后最大比生长速率显著高于一次性添加营养盐组（表1，P＜0.05）。

同步分析水体中硝酸盐和磷酸盐的含量可以看出（图2－3），两种藻类的生长情况跟水体营养盐水平非常相关，一开始无论是硝酸盐还是磷酸盐都有一个下降过程，主要是藻类生长处于指数期需要大量营养盐支撑，之后营养盐水平略有波动，藻类生长处于稳定期，第12天后再次添加营养盐后，硝酸盐和磷酸盐浓度快速上升，之后随着藻类的再次快速生长又被消耗。但是两种藻类对营养盐的吸收利用情况有所不同，东海原甲藻对硝酸盐的吸收利用不高，一次性添加营养盐的培养组中东海原甲藻对硝酸盐的吸收利用率为31.6%，第12天添加营养盐的培养组东海原甲藻对硝酸盐的吸收利用率为12.9%（第12天添加营养盐后计算）。而对磷酸盐的吸收利用则较高，一次性添加营养盐的培养组中东海原甲藻对磷酸盐的吸收利用率为76.9%，第12天添加营养盐的培养组中东海原甲藻对磷酸盐的吸收利用率为57.3%（第12天添加营养盐后计算）。米氏凯伦藻则对硝酸盐和磷酸盐的吸收利用都非常高，一次性添加营养盐的培养组中米氏凯伦藻对硝酸盐和磷酸盐的吸收利用率分别为92.5%和99.9%，第12天添加营养盐的培养组中米氏凯伦藻对硝酸盐和磷酸盐的吸收利用率为93.6%和99.6%（第12天添加营养盐后计算）。另外，米氏凯伦藻的生长速率也远远大于东海原甲藻，两者的细胞浓度基本上相差一个数量级（图1），所以米氏凯伦藻对营养盐的需求高于东海原甲藻。

2.2 磷限制对两种藻类生长的影响

由图4可知，磷限制对东海原甲藻生长的影响显著，正常营养盐水平培养组中东海原甲藻从第6天开始到实验结束细胞浓度均显著高于磷限制组（P＜0.05），在实验后期磷限制组中的东海原甲藻细胞浓度始终处于一个很低的水平（＜10 000 cell·mL－1）。米氏凯伦藻的情况与东海原甲藻类似，正常营养盐水平培养组中米氏凯伦藻从第9开始到实验结束细胞浓度均显著高于磷限制组（P＜0.05），但是米氏凯伦藻在磷限制情况下细胞浓度一直比较稳定在20 000 cell· mL－1这个级别上，到实验结束（第24天）才降至10 000 cell·mL－1以下。因此，米氏凯伦藻相比东海原甲藻更耐低磷。

表1 不同营养盐水平对东海原甲藻和米氏凯伦藻生长速率的影响（d－1）Tab.1 Effect of different nutrients levels on the specific grow th rate of P.donghaiense and K.m ikimotoi（d－1）

图1 不同营养盐水平对东海原甲藻和米氏凯伦藻生长的影响Fig.1 Effects of different nutrients levels on the grow th of P.donghaiense and K.m ikimotoi

图2 东海原甲藻生长过程中水体硝酸盐和磷酸盐的变化Fig.2 Changes of-N and-P in P.donghaiense group

图3 米氏凯伦藻生长过程中水体硝酸盐和磷酸盐的变化Fig.3 Changes of-N and-P in K.mikimotoi group

2.3 磷限制对东海原甲藻和米氏凯伦藻细胞体积的影响

磷限制组中东海原甲藻细胞体积在不同培养时间以及最后的磷酸盐恢复培养中变化相差不大（P＞0.05）。东海原甲藻细胞长度和宽度分别约为20μm和10μm左右（表2）。而磷限制组中米氏凯伦藻细胞体积会随着培养时间的增加而增大。从表3可知，低磷培养第9天后就发现有不少细胞体积增大的个体，通过显微测量40个细胞发现平均体长为14.56μm，体宽为12.09μm明显大于对照组中米氏凯伦藻的平均体长和体宽（11.27μm和9.01μm），低磷培养18 d后这种趋势更加明显，细胞体积大于对照组和低磷培养9 d中的米氏凯伦藻，低磷培养24 d后米氏凯伦藻体积有所缩小但仍然大于对照组（P＜0.05）。另外，第18天后低磷培养组重新添加磷酸盐后，恢复培养6 d后米氏凯伦藻体积又恢复正常和对照组没有明显差异甚至还略小于对照组。

表2 磷限制对东海原甲藻细胞体积的影响Tab.2 Volum e of P.donghaiense in phosphorus lim iting conditions

表3 磷限制对米氏凯伦藻细胞体积的影响Tab.3 Volume of K.m ikimotoi in phosphorus lim iting conditions

图4 不同磷酸盐水平对东海原甲藻和米氏凯伦藻生长的影响Fig.4 Effects of different-P levels on the grow th of P.donghaiense and K.mikimotoi

3 讨论

氮和磷是浮游植物生长所必需的主要元素，氮在细胞代谢中是形成氨基酸、嘌呤、氨基糖和胺类化合物的基本元素，磷则直接参与光合作用的各个环节，包括光能吸收电子传递、卡尔文循环以及对一些酶的活性起调节作用等［21］。本实验研究了不同营养盐水平以及磷限制的情况下东海原甲藻和米氏凯伦藻生长以及细胞体积的变化。结果表明，实验中期（第12天）再次补充营养盐后两种甲藻的生长均显著优于一次性添加营养盐的组别（P＜0.05，图1），在磷限制下两种甲藻生长受到抑制的情况更加明显（P＜0.05，图4）。王正方等［22］的实验结果也表明硝酸盐浓度在0.04～0.30 mol·L－1时能较好地维持海洋原甲藻（P.micans）的增殖，而磷比氮更能限制海洋原甲藻的增殖。东海原甲藻对氮的吸收利用率不高，而且主要集中在培养前期（细胞处于指数生长期），而米氏凯伦藻对氮的吸收利用率则较高，在培养后期也持续利用（图2－3），也就是说米氏凯伦藻的生长对氮需求更高。欧美姗［23］也报道东海原甲藻对无机氮的吸收主要集中在指数生长期，用于藻细胞的生长需要，而在稳定期吸收则不多。黄凯旋［6］研究指出当磷酸盐浓度为0.65μmol·L－1时，米氏凯伦藻细胞对四种氮源（氯化铵、硝酸钠、亚硝酸钠和尿素）的吸收范围为0.04～0.05mol·L－1。如果海区营养盐丰富，米氏凯伦藻爆发赤潮的几率就大大增加，龙华等［24］通过现场调查也指出米氏凯伦藻的细胞密度与营养指数和磷酸盐浓度呈正相关性，高营养指数、丰富的磷酸盐含量和低氮磷比是米氏凯伦藻赤潮形成的重要条件。另外，米氏凯伦藻生理适宜的氮磷比范围较大，有较强的环境适应能力，由于环境会优先选择与之相适应的特征种，形成适者生存的群落，因此这也是米氏凯伦藻能够在适宜的环境条件下，从浮游植物种类之间的竞争中获胜，成为优势种并快速增殖，最后爆发大规模赤潮的原因之一［11］。

奢侈系数R［25］和生长潜力T［26］，都可以用来评价藻细胞内所储存的营养对细胞生长繁殖的效用价值。其中，甲藻与硅藻相比具有较高的营养储存能力，东海原甲藻细胞对氮的营养储存能力RN值（41.5）和对磷的营养储存能力RP值（4.3），明显高于硅藻代表钟中肋骨条藻与的RN（2.6）和RP（2.5）。东海原甲藻利用胞内氮的细胞生长潜力TN值（5.32 d）和利用胞内磷的细胞生长潜力TP值（2.08 d），也明显高于中肋骨条藻的TN（0.56 d）和TP（0.53 d）［27］。在本实验中，东海原甲藻在低磷水平下（＜0.5 mg·L－1）细胞浓度还保持较高水平（＞4.0×104cells· mL－1）维持近半个月（图1－2），而米氏凯伦藻更是在相当低的氮（＜1.0 mg·L－1）和磷（＜0.05 mg·L－1）浓度下细胞数量保持高浓度（＞3.0× 105cells·mL－1）维持超过半个月（图1、3）。这充分说明这两种甲藻细胞内可以储存的很多氮磷等营养元素，米氏凯伦藻尤其多。

另外，实验中发现米氏凯伦藻细胞体积也随着低磷培养时间的延长而持续保持明显大于对照组的体积，磷得到补充后细胞体积迅速恢复正常大小（表3）。类似的现象出现在另外一种甲藻（Gymnodinium catenatum）上，在缺少磷酸盐的情况下培养6 d后发现藻细胞体积变大2倍［16］。这可能是藻类遇到不良环境时的一种应激反应，在某些情况下是可逆的，比如环境中磷的减少或缺乏，某些藻类可以利用细胞内营养盐库的调节来缓解，只要藻类细胞内营养库没有耗尽，当环境恢复到原先状态时藻类体积也恢复正常。另外一种情形是某些藻类受到其它藻类化感物质的影响时，藻细胞很快就受到影响，并且这种变化往往是不可逆的，比如Rhodomonassp.在P.parvum过滤液的培养下就会发生细胞水肿变大最后分解的现象［17］，赤潮异湾藻（Heterosigmaakashiw）在中肋骨条藻过滤藻液的培养下也出现相似的结果［18］。

东海近海海域富营养化面积已居中国四大海区之首，并成为我国比较典型的赤潮高发区，东海原甲藻和米氏凯伦藻逐渐成为海区甲藻赤潮的优势种。在海洋复杂环境下，研究各种环境因子以及协同效应对赤潮藻类生理生化的影响显得尤为重要，今后可以结合分子生物学手段，在磷限制情况下针对东海原甲藻和米氏凯伦藻生长特性与细胞周期关键调控因子之间的关系、碱性磷酸酶（在磷吸收代谢过程中扮演重要角色）酶活性以及蛋白基因表达水平等方面开展深入研究。

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Effects of different nutrients levels on the grow th of Prorocentrum donghaiense and Karenia m ikimotoi

SHEN Ang-lv1，2，LIDao-ji2
（1.Key Laboratory of East China Sea＆Oceanic Fishery Resources Exploitation and Utilization，Ministry of Agriculture，East China Sea Fisheries Research Institute，Shanghai200090，China；2.State Key Laboratory of Estuarine and Coastal Research，East China Normal University，Shanghai200062，China）

Harmful algal blooms（HABs）is an increasingly serious marine environmental problem for aquaculture，fisheries and public health in many coastal areas throughout the world.HABs has become common in the Yangtze Estuary and East China Sea（ECS）since 1980s.Prorocentrum donghaienseandKarenia mikimotoihave been major harmful bloom species in HAB areas of the East China Sea（ECS）in recent years.Nutrients are important environmental factors related to microalgae growth，and can affect the population dynamics of individual species and species succession in the field.To understand the growth characteristics ofP.donghaienseandK.mikimotoi，the effects of different nutrients levels and phosphorus limitation on the growth were examined.In the present study，P.donghaienseandK.mikimotoiwere cultured under two nutrient concentrations（f/2 medium added once and f/2 medium added twice）and two phosphate concentrations（f/2 medium and f/2 medium without NaH2PO4·H2O）.In addition，the length and width ofP.donghaienseandK.mikimotoiweremeasured by themicroscope on 0，9，18 d and 24 d in phosphorus limitation groups，and after recovery culture for 6 d（added NaH2PO4·H2O with f/2 medium level）.In the two nutrient concentrations culture experiment，the results showed that the growth of two species were significantly different by different nutrient levels（P＜0.05），and cell densities in high nutrient level group were higher than that in low nutrient level group，the specific growth（μ）ofP.donghaiensein two nutrient level groups were 0.068 d－1and 0.034 d－1（from 12 d to 33 d），and the specific growth（μ）ofK.mikimotoiwere 0.108 d－1and 0.069 d－1，respectively.In addition，Prorocentrum donghaiensehas high absorption efficiency of phosphate（76.9%）andK.mikimotoihas high absorption efficiency of both phosphate（99.9%）and nitrate（92.5%）when determination of the nutrients is done synchronously.Furthermore，two species could survive with a high cell concentration for a long time in the low phosphorus condition，indicating that there are nutrient database in the two species.In the two phosphate concentrations culture experiments，results showed that the growth ofP.donghaiensewas surpressed remarkably（P＜0.05）in phosphorus limiting conditions on 6 d，and the cell density was always at a very low level（＜10 000 cell·mL－1）in the last 10 d；there was no significant difference in the volume ofP.donghaiensebetween two phosphate concentration cultures.The growth ofK.mikimotoiwas surpressed remarkably（P＜0.05）in phosphorus limiting conditions on 9 d，but the cell density was always at20 000 cell·mL－1from 9 d to 18 d；the cell volume ofK.mikimotoiwas larger than the control from 9 d to 24 d（P＜0.05），and the cell volume restored to the normal level when the phosphorus concentration returned to f/2 medium levels.The results in the present study could be used to understand the growth competition mechanism ofP.donghaienseandK.mikimotoiin different nutrient levels.

Prorocentrum donghaiense；Karenia mikimotoi；nutrient；growth

Q 948.8

A

1004－2490（2016）04－0415－09

2015－10－30

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目（中国水产科学研究院东海水产研究所，2015M06）；科技部项目全球变化重大科学研究计划（2010CB951203）

沈盎绿（1980－），男，浙江象山人，博士，副研究员，主要研究方向为河口海岸学。

E-mail：shenanglv＠163.com