江罗佳，秦晓华，黄 翀，房向东，涂卫平



·论著·

重组人促红细胞生成素治疗肾间质纤维化的作用机制研究

江罗佳，秦晓华，黄 翀，房向东，涂卫平

【摘要】目的探讨重组人促红细胞生成素(rHuEPO)治疗肾间质纤维化(RIF)的作用机制。方法2014年7月—2015年6月，将人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)随机分为7组：空白对照组(E1组)：未加任何刺激物；rHuEPO对照组(E2组)：rHuEPO终浓度为20 U/ml；人纯化清蛋白诱导组(E3组)：人纯化清蛋白终浓度为5 mg/ml；E4组：加人纯化清蛋白(5 mg/ml)和rHuEPO(5 U/ml)；E5组：加人纯化清蛋白(5 mg/ml)和rHuEPO(10 U/ml)；E6组：加人纯化清蛋白(5 mg/ml)和rHuEPO(20 U/ml)；Rho相关卷曲螺旋形成的蛋白激酶(ROCK)抑制剂Y27632组(E7组)：加ROCK抑制剂Y27632(10 μmol/L)，30 min后加人纯化清蛋白(5 mg/ml)。采用细胞增殖试验检测刺激16、24、48、72 h时各组细胞增殖数，反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测RhoA、ROCK mRNA表达水平，细胞免疫荧光法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达水平，酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测纤维连接蛋白(FN)表达水平。结果16 h时，各组细胞增殖数比较，差异无统计学意义(P>0.05)。24、48、72 h时，各组细胞增殖数比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中E3～E6组高于E1组、E2组，E4～E6组高于E3组，E7组低于E3组，E5组、E6组高于E4组，E6组高于E5组(P<0.05)。各组RhoA mRNA表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中E3～E6组高于E1组、E2组，E4～E6组低于E3组，E5组、E6组低于E4组，E6组低于E5组(P<0.05)。各组ROCK mRNA表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中E3～E6组高于E1组、E2组，E4～E7组低于E3组，E5组、E6组低于E4组，E6组低于E5组(P<0.05)。各组α-SMA表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中E3～E5组高于E1组、E2组，E4～E7组低于E3组，E5组、E6组低于E4组，E6组低于E5组(P<0.05)。各组E-cadherin表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中E3～E6组低于E1组、E2组，E4～E7组高于E3组，E5组、E6组高于E4组，E6组高于E5组(P<0.05)。各组FN表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中E3～E5组高于E1组、E2组，E4～E7组低于E3组，E5组、E6组低于E4组，E6组低于E5组(P<0.05)。E3组、E4组、E5组、E6组RhoA mRNA与ROCK mRNA均呈正相关(P<0.05)。结论人纯化清蛋白能诱导HK-2细胞发生上皮细胞-间充质细胞转分化(EMT)，进而发生RIF，而rHuEPO通过阻断EMT的RhoA/ROCK信号转导通路从而抑制RIF发生，且在一定范围内rHuEPO水平越高，其抑制作用越强。

肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis，RIF)是逐步进展成慢性肾衰竭的一个必经之路。探讨一种新的、针对性的治疗方案，阻断甚至逆转RIF的进展，在延缓慢性肾脏病进展中显得尤其重要。在RIF过程中，肾小管基底膜损害的同时常伴有肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞样细胞转分化，这种现象被称作“上皮细胞-间充质细胞转分化(epithelial-mesenchymal transformation，EMT)”，各种细胞因子、生长因子、激素等均参与并协同完成EMT过程[1-3]。近几年，有学者认为，在EMT过程中，RhoA/Rho相关卷曲螺旋形成的蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil-forming protein kinase，ROCK)与转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGFβ1)/smads是2条并行的信号转导通路[4-5]。本……