张 超， 朱三荣， 田 峰， 戴林建， 陈 武2,*

(1.湖南农业大学 植物保护学院， 湖南 长沙 410128； 2.湖南农业大学 植物与微生物分子互作实验室， 湖南 长沙 410128； 3.湖南省烟草公司 湘西自治州公司， 湖南 湘西 416000； 4.湖南农业大学 农学院， 湖南 长沙 410128)

不同绿肥对湘西烟田土壤细菌群落结构与多样性的影响

张 超1,2， 朱三荣3， 田 峰3， 戴林建4， 陈 武2,4*

(1.湖南农业大学 植物保护学院， 湖南 长沙 410128； 2.湖南农业大学 植物与微生物分子互作实验室， 湖南 长沙 410128； 3.湖南省烟草公司 湘西自治州公司， 湖南 湘西 416000； 4.湖南农业大学 农学院， 湖南 长沙 410128)

为了解施用不同绿肥烟田土壤细菌群落的物种多样性，从湖南省湘西州烟区采集4块烟田(不施绿肥，单施黑麦草绿肥，豌豆绿肥，油菜绿肥)的土壤样本，提取土壤总DNA，PCR扩增其16S rRNA的V4高变区，阳性样品测序，序列比对鉴定，并利用生物信息学软件分析测序数据。结果表明：1) 施用绿肥对土壤细菌群落结构和组成具有显著影响。在细菌域有4个主要的细菌种群，占所有有效序列的55.79%～65.39%，分别为变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和绿弯菌门(Chloroflexi)，4个细菌种群相对丰度在各组均具有显著差异。2) 经绿肥处理后的烟田土壤细菌群落多样性高于未施用绿肥的对照组。香农多样性指数和群落均一度指数对照组(6.637, 0.833)和油菜组(6.658, 0.833)均低于黑麦草组(6.923, 0.854)和豌豆组(6.992, 0.861)，且差异均达显著水平。3) 施用绿肥尤其是黑麦草绿肥的烟田中，烟草青枯病的发病率下降与土壤细菌群落多样性增加有关。

绿肥； 细菌群落； 结构与组成； 微生物多样性

烟草是我国主要的经济作物之一，长期以来烟草产业对国家财政收入贡献巨大。湘西自治州是湖南省主要的烟草产区，目前湘西州烟区烟田连作障碍发生频繁，土传病害较为严重，急需建立综合防治技术体系。连作障碍是在同一地块连续两茬以上种植同一种作物导致的作物长势变弱，品质劣化，作物病虫害频发最终导致产量下降的现象[1]。作为连作障碍现象的一种，烟草作物土传病害(包括烟草青枯病)在我国发生普遍。烟草青枯病由茄科雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起，是一种典型的土传性病害[2]。研究表明，作物土传病害的发生与根际土壤微生物的数量、组成和群落结构密切相关[3-5]。很多学者认为[6-8]，土壤微生物群体可一定程度上抑制作物的土传病害，微生物群落结构越丰富，多样性越高，对抗病原菌的综合能力越强。

绿肥在农业生产中扮演着土壤改良剂的角色，在抑制作物病虫害和提高作物产量等方面具有极其重要的意义。有研究指出[9]，施用绿肥对于作物土传病原菌可起到抑制作用。但不同绿肥对于不同土壤中微生物的影响不尽相同。

16S rRNA是原核生物核糖体RNA，其高度的保守性使之成为分子生物学研究的热点之一[10]。16S rRNA高通量测序技术能同时对样品中的优势物种、稀有物种和一些未知的物种进行检测，获得样品中微生物群落组成及其相对丰度。研究表明[11-13]，相较于一些传统微生物研究方法，高通量测序技术具有通量高、成本低、流程自动化且能获取更丰富微生物信息的优势，Illumina MiSeq是高通量测序技术的一种。故笔者采用Illumina MiSeq测序平台进行样品的测序，通过生物信息学统计分析测序结果，研究4块烟田土壤中细菌群落结构组成的差异，并试图从土壤微生物的生态角度解释不同绿肥处理后土壤细菌群落结构的变化与烟草青枯病发病率之间的联系，以期为湖南省湘西州烟草产区土传病害的综合防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品的采集

供试土壤取于湖南省湘西州花垣县烟田。采样农田分为4个处理组：对照组(Control)、黑麦草组(Ryegrass)、豌豆组(Pea)和油菜组(Rape)，对照组不施绿肥。采样方法：土钻垂直打下20 cm深度取土，每块烟田按照棋盘式采样法选择10个点进行采集。采样范围为E 109°34′13″～34′41″，N 28°22′8″～22′12″。采样时间为2014年7月28日(烟草成熟期或发病盛期)。土壤样品采集后低温保存带回并置于-80℃冰箱备用。

1.2 样品总 DNA提取和16S r RNA 片段的 PCR扩增

1.2.1 样品总DNA提取 样品总DNA采用MOBIO PowerSoil DNA Isolation Kit试剂盒提取，提取步骤依照试剂盒说明书进行。

1.2.2 16S rRNA片段的PCR扩增 根据Miseq测序平台的要求设计引物，序列为515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R (5′- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。PCR反应体系：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环，72℃延伸7 min，4℃保存。

1.3 PCR产物的Miseq 高通量测序

测序由中南大学资源生物与生物工程学院生物冶金重点实验室完成。

1.4 数据处理

通过UCULT软件对每个样品的16S rRNA有效序列比对结果进行聚类，相似度>97%的归为同一个OTU(operational taxonomic units，操作分类单位)。后续分析基于软件R语言、SPSS和在线分析网站(http://ieg.ou.edu/)完成。各组指标数据差异的显著性水平通过基于最小显著性差异法(Least Significant Difference test，LSD)的单因素方差分析(one-way analysis of variance，ANOVA)进行判断。采用除趋势对应分析法研究研究土壤细菌群落结构差异，采用香农多样性指数(Shannon diversity)和群落物种均一度指数(Pielou evenness)评价烟田细菌的群落多样性。

2 结果与分析

2.1 16S rRNA序列 PCR扩增

由图1可见，通过515F/806R引物PCR扩增40个土壤样品的总DNA，目的片段约为500 bp。

2.2 不同绿肥处理烟田土壤细菌群落的结构与组成

每个样品中均得到约18 000条高质量的16S rRNA有效序列，在OTU聚类完成后鉴定得到14 629个OTUs。其中，有127个OTUs被分类为古菌，其余为细菌。根据对OTUs统计得出，在古菌域中，62.28%的序列被鉴定为嗜热的厌氧有机营养古菌(Fervidicoccus)[14]，还有26.21%的序列为广古菌门(Euryarchaeota)中未被鉴定的属。由图2可见，细菌域中，在门的水平上有4个主要的细菌种群占所有序列的多数(55.79%～65.39%)，其中，变形菌门(Proteobacteria)占21.69%～41.44%，酸杆菌门(Acidobacteria)占13.05%～23.62%，放线菌门(Actinobacteria)占4.13%～8.13%，绿弯菌门(Chloroflexi)占2.78% ～ 16.24%，这与前人的研究相印证[15-17]。同时，还有11.78%～22.65%的序列鉴定结果与已知菌门不相匹配。

注：1～10代表对照组样品，11～20号代表黑麦草组样品，21～30号代表豌豆组样品，31～40号代表油菜组样品。

Note: 1～10, control ;11～20, ryegrass; 21～30, pea; 31～40, rape.

图1 40个样品 515F/806R引物的扩增图谱

Fig.1 PCR results of 40 strains with primer 515F/806R

图2 4个处理组中土壤细菌群落的结构与组成

Fig.2 Composition and structure of soil bacteria communities in four group

注：A，门水平；B，属水平；同一组别不同小写字母表示差异达显著性水平(P< 0.05) 。

Note: a， phylum level, b, genus level; Significant differences (P< 0.05) among four groups are labeled with alphabet.

图3 供试烟田中主要细菌种群在门和属水平上的相对丰度

Fig.3 Relative abundances of major bacterial populations in four groups

2.3 不同绿肥处理下烟田优势细菌群落的相对丰度

从图3A可见，在门的水平上，对照组中变形菌和放线菌(Proteobacteria,Actinobacteria)的相对丰度更高，而泉古菌(Crenarchaeota)的丰度在油菜组中更高；酸杆菌(Acidobacteria)的丰度在豌豆组中最高，在对照组中最低；浮霉菌(Planctomycetes)和绿弯菌(Chloroflexi)在黑麦草组中的丰度更高。绿肥的施用对土壤细菌群落的结构和组成有显著影响。由图3B可见，在属的水平上，酸杆菌门的3个分属Acidobacteria_Gp6，Acidobacteria_Gp4和Gp16在豌豆组中丰度更高。疣微菌门的分属Spartobacteria_genera_incertae_sedis，芽单孢菌属Gemmatimonas，黄色单胞菌科的分属Dokdonella和Rhodanobacter4个属在对照组丰度更高。

如图4可见，除对照组和油菜组中有部分点距离很近外，4个组的细菌群落能明显区分开。表明，除油菜组和对照组部分样品中群落结构相似之外，各组土壤之间细菌的群落结构均具有显著差异。

图4 各组样品中16 S rRNA序列的除趋势

Fig.4 Detrended correspondence analysis (DCA) of 16r RNA gene sequencing data

2.4 不同绿肥处理下烟田土壤细菌的多样性

由表可知：香农多样性指数和群落均一度指数对照组(6.637, 0.833)和油菜组(6.658, 0.833)均低于黑麦草组(6.923, 0.854)和豌豆组(6.992, 0.861)，且差异均达显著水平。说明，施用不同绿肥的烟田土壤细菌群落的物种丰富度和多样性都高于对照组；而另一个用于评价多样性的指数chao值也呈现此规律。

表 不同绿肥处理对烟田土壤细菌的多样性

注：同行不同小写字母表示差异达显著性水平。

Note: Different lowercase letters in the same column indicated 5% significant level.

3 结论与讨论

通过烟田调查统计得出4块烟田的烟草青枯病发病率，分别为对照组80.45%，黑麦草组3.38%，豌豆组8.78%，油菜组22.97%。综合对4块烟田细菌群落组成和结构及其多样性变化：相比对照组，3种绿肥处理后能提高烟田土壤细菌群落的多样性并降低烟草青枯病的发病率，黑麦草组尤为明显。这可能是由于不同绿肥的成分不同，在土壤中对于细菌群落的影响也不相同。

由于土壤微生物和植物之间的联系十分复杂，仅仅测定微生物群落结构并不能完全说明施用绿肥对土壤质量的提高[18]。土壤微生物同时还受到土壤性质和绿肥中功能成分的影响，因此，还需要将土壤性质、细菌群落和绿肥三者综合并对烟田土壤细菌群落的功能多样性和有益菌、有害菌与病原菌之间的相互作用进行深入的研究，为烟田绿肥的合理选择和农业生产系统的优化提供科学依据。

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(责任编辑： 刘忠丽)

Effects of Different Green Manure on Bacterial Community Structure and Diversity in Tobacco-planting Field in Xiangxi

ZHANG Chao1,2, ZHU Sanrong3, TIAN Feng3, DAI Linjian4, CHEN Wu2,4*

(1.CollegeofPlantProtection,HunanAgriculturalUniversity,Changsha,Hunan410128; 2.MolecularInteractionLaboratoryofPlantandMicroorganism,Changsha,Hunan410128; 3.XiangxiBranchCompany,HunanTobaccoCompany,Xiangxi,Hunan416000; 4.AgriculturalCollege,HunanAgriculturalUniversity,Changsha,Hunan410128,China)

In order to explore the species diversity of bacterial community in tobacco-planting field applied with different green manure, soil samples were collected in four tobacco-planting fields in Xiangxi, Hunan Province, which were treated with different green manure(control, ryegrass, pea and rape), after extracting total DNA from soil, PCR amplification of V4 hypervariable region of 16S rRNA, positive sample sequencing and alignment, and then sequence data were analyzed by using bioinformatics software. Results: Applying green manure had positive influence on soil bacteria community structure and composition. Within the bacterial domain, four major bacterial phyla accounted for 55.79% to 65.39% of all reads, and they were Proteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria and Chloroflexi. Soil community diversity was significantly higher in groups treated with green manure.Shannon diversity index and Pielou evenness index were significantly (P<0.05) lower in Control (6.637, 0.833) and Rape (6.658, 0.833), but higher in Ryegrass (6.923, 0.854) and Pea (6.992, 0.861) . Green manure especially ryegrass, decreased tobacco disease (bacterial wilt) rate dramatically, which correlated with the increasing of soil bacteria community diversity.

green manure; bacterial communities; structure and composition; microbial diversity

2016-03-31； 2016-05-04修回

国家烟草专卖局重点项目(110201302014)；湖南省烟草公司湘西自治州分公司科技项目(XX14-16Aa05)

张 超(1991-)，男，在读硕士，研究方向：植物病理学。E-mail:zhangchaom200@163.com

*通讯作者：陈 武(1977-)，男，副教授，从事植物病理学研究。E-mail: chenwuwarrior@163.com

1001-3601(2016)05-0198-0043-04

S435.5

A