吴冉（西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041）

小反刍兽疫及诊断方法的研究进展

吴冉
（西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041）

小反刍兽疫；诊断方法；研究进展

小反刍兽疫是近年来对畜牧业生产安全造成严重危害的跨国动物疫病之一，在我国及周边许多国家呈地方性流行趋势，我国近期多个省份出现确诊疫情，引起了国家农业部的高度重视。

1　流行病学调查

小反刍兽疫（PPR）是一种高度接触性传染病，主要感染小反刍兽，尤其是山羊和绵羊。小反刍兽疫的传染性强，有较高的发病率和致死率。小反刍兽疫在我国及邻近国家频繁发生，对畜牧业经济发展造成了严重的威胁。健康动物主要通过与病畜直接接触传播，呼吸道是主要的感染途径，该病在潮湿寒冷的季节多发。小反刍兽疫属于一种外来动物疫病，我国于2007年7月首次确诊西藏阿里地区出现的小反刍兽疫疫情，2013年11月，新疆几个市县发生了PPR疫情，疫情逐渐向内地扩散。

2　实验室诊断

小反刍兽疫是一种严重的急性、烈性和高度接触性传染病，因此PPRV病毒的分离和血清学检测等试验都必须在生物安全3级以上的实验室进行。

2.1病毒的分离培养采集病毒样本最佳的时期是动物高热之后腹泻之前，可通过采取病畜的鼻腔、口腔、眼结膜、肠管等处的分泌物棉拭子，剖检脾脏，肺脏和淋巴结等组织，也可采集病畜血液样本。将可疑病料在原代绵羊胎肾细胞或非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）上培养增殖，5～6d后观察PPRV可产生细胞病变效应（CPE），细胞变大变圆，逐渐融合形成合胞体。

2.2中和试验（NT） NT是一种基于抗原抗体特异性的免疫学检测方法，即可用已知的PPRV抗原检测其相应的抗体，也可用PPRV特异性抗体鉴定PPRV，通常是在原代羔羊细胞或Vero细胞上完成NT，是国际贸易中规定的PPRV诊断方法。NT方法的特异性强，可以用于PPRV和RPV的鉴别，也可以鉴别不同PPRV毒株之间的差异，缺点是检测速度慢，很难实现较多样品的检测。

2.3凝胶免疫扩散试验（AGID）AGID在临床中广泛应用，操作方法简单，实验成本低，在野外和一般实验室均能操作，24h以内可获得结果。但是AGID试验的敏感性较低，当抗原含量较低时，不容易将抗原检测出来，所以一般不会作为诊断的标准方法。

2.4对流免疫电泳（CIEP）CIEP是目前最快的一种检测方法，由于抗原抗体在电场中做定向移动，减少了自由扩散，在一定程度上增加了抗原抗体的浓度，使该方法具有较高的敏感性，可作为PPRV的临床检测的一种有用的筛选试验方法。但是CIEP试验特异性差，不能鉴别PPRV和RPV的感染。

2.5间接免疫荧光抗体试验（IFAT）Sumption等通过应用PPRV的特异性单克隆抗体，建立了间接荧光抗体试验（IFAT），该方法可以将PPRV感染发病早期及晚期病料中的病毒抗原检测出来，并能对PPR和RP进行快速鉴别诊断。曲林茂等以重组的PPRV-F蛋白为抗原对家兔进行免疫接种，制备出的多克隆抗体作为一抗用来捕获病料中的抗原，二抗为羊抗兔的IgG，IFAT方法能够特异性地将PPRV诊断出来。IFAT操作复杂，检测时间长，对实验设备要求高，因此不适用于对大量样本进行检测。

2.6酶联免疫吸附试验（ELISA）

2.6.1竞争ELISA（c-ELISA）感染PPRV的动物的血清中有针对PPRV H蛋白和N蛋白的部分抗体，学者在其单克隆抗体的基础上建立了竞争ELISA（c-ELISA）方法，该方法比于VNT方法方便快捷，可应用于对大量野外样品进行迅速鉴定。世界动物卫生组织（OIE）指定c-ELISA为PPRV标准检测方法之一，该方法用时较短且敏感性高，能实现检测的大批量化。Choi等建立了一种快速竞争ELISA（rapid c-ELISA），用于PPR的检测和监控。

2.6.2夹心ELISA（s-ELISA） 夹心ELISA的原理是利用多克隆抗体能够将临床样品中的PPRV抗原捕获，用针对PPRV-N蛋白的单克隆抗体可以对捕获的抗原进行检测，基于单克隆抗体，建立了夹心ELISA方法。s-ELISA方法特异性强，操作方便，24h内即可获得检测结果，可以对临床样品进行快速检测，可用于PPR疫苗的质量控制，但不能鉴别PPRV和RPV的感染。

2.6.3间接 ELISA（i-ELISA）由于 PPRV N蛋白的454-472位氨基酸序列具有非常强的免疫原性，是PPRV特有的，多肽抗体能够特异性识别这一区域，于是Balamurugan等在多抗的基础上建立了间接ELISA的方法，用c-ELISA、i-ELISA和VNT三种方法同时对1544份PPR病料进行检测，与c-ELISA相比，i-ELISA检测样品的特异性为95.09%，敏感性为90.81%；与VNT相比，i-ELISA检测样品的特异性和敏感性分别为100%和80%。上述研究试验的结果表明i-ELISA方法的特异性和敏感性比c-ELISA和VNT高，可用于PPRV的流行病学研究。

2.6.4双抗夹心ELISA（DAS-ELISA）何红菊等纯化的PPRV单抗和多抗为基础，通过棋盘法优化条件，建立了双抗夹心ELISA检测方法，对临床样品检测结果与RT-PCR进行比较，验证了DAS-ELISA方法的特异性，灵敏性和高效性，其灵敏度为RT-PCR的1.2倍左右。DAS-ELISA方法对仪器设备要求低，通过利用特异性反应比较高的亲和素和生物素或者酶的三次放大，使该方法具有高灵敏度和特异性，可对大量临床样品进行快速检测。

2.7核酸探针杂交试验随着基因在工程近年来的快速发展，PPRV的全部基因被克隆了出来，学者并在此基础上建立了利用cDNA探针对核酸进行标记的核酸杂交方法。cDNA探针必须用32P或地高辛等进行标记，以检测双链复合体的PPRV基因序列。由于32P同位素的半衰期较短，放射性元素对人体危害较大和对设备防护条件要求较高等原因，使该方法不能广泛应用。

2.8RT-PCR方法RT-PCR是目前被广泛应用的一种检测技术，特异性高，检测所需样品少，在短时间内可以得到检测结果。RT-PCR方法是1995年首次建立的，可快速鉴别PPRV和RPV。包静月等建立了实时定量RT-PCR，可以采取病畜血液样本进行检测，特异性强，灵敏度高，操作简单，且减少了PCR的污染。

2.9PCR-ELISA方法Saravanan等基于PPRV-N蛋白基因建立了一种高特异性和灵敏的PCR-ELISA检测方法，利用RT-PCR方法扩增地高辛标记的336bp的产物，将生物素标记的探针与扩增的产物特异的杂交后，再用ELISA检测扩增产物，可以检测出特异性的N基因片段，该方法的灵敏度远高于传统 PCR，敏感性也高于 s-ELISA，因此，PCR-ELISA更适用于对PPRV感染早期及后期病原的检测，特异性高使其能够有效鉴别PPRV和RPV。

2.10荧光抗体检测技术蒋梅等选用PPRV Nigeria 75/1减毒疫苗株制备抗原，然后用制备出的抗原对试验山羊进行免疫，以此制备出PPRV的高免血清，将免球蛋疫白（IgG）用硫酸铵盐析法粗提出来，再用提取出的IgG制备异硫氰酸荧光素标记抗体，试验结果表明，该方法的敏感性强，可检测出1×106病毒稀释度的细胞培养物，可在实验室条件下特异性鉴别PPRV和CDV，诊断过程可在24h内完成。

2.11RT-LAMP方法李伟等建立了检测PPRV的一步法反转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）方法，该方法设计出针对PPRV-N基因的保守区域的4条引物，在Bst大片段聚合酶的作用下对DNA进行梯状等温扩增。该方法的耗费低，不需要使用PCR仪；反应迅速，在1h内可以完成反应，其反应结果易于观察，可直接用肉眼观察反应管中的浑浊程度来判断阳性与否；特异性强，可将PPRV和同属的CDV鉴别出来；灵敏度比较高，最低可以将7个拷贝的病毒RNA模板检测出来。

2.12免疫过氧化物酶单层试验（IPMA） IPMA方法的原理是通过将二抗用辣根过氧化物酶（HRP）进行标记，标记之后的二抗不仅具有与血清中的一抗特异性结合的特性，又具有酶的活性，当二抗与一抗进行孵育之后，再加入酶的底物，二抗上标记的酶会与加入的底物发生反应并产生肉眼可识别的颜色。如加入的底物为3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）并产生红棕色的不溶性产物，附着在细胞的表面，在光学显微镜下观察即可判定结果并且可长期保存。

2.13PPR-LIPS法Berguido等建立了一种可以检测PPR的荧光素酶免疫沉淀检测方法（PPR-LIPS），该方法构建一个将PPR-N蛋白420～525氨基酸片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染Vero细胞系，加入特定的荧光素酶和底物，酶与底物反应后会产生荧光，荧光的强度与荧光素酶的活性相关。该方法具有较高的敏感性和特异性，仅需要1μL样品即可进行PPRV检测，未来会是PPR血清学检测的重要方法。

3　结　语

近年来小反刍兽疫疫情在我国许多省份不断发生和流行，对我国及邻近国家的动物安全和畜牧业经济发展造成了严重威胁，因此加强小反刍兽疫诊断方法的研究，建立安全简便，快速灵敏的诊断方法，对于该病的研究和预防控制都具有很重要的意义。

［1］俄日姐.小反刍兽疫的防治不可松懈［J］.中国动物保健，2016，18 （1）：37-38.

［2］王春霞.一起小反刍兽疫的诊断及病原分离鉴定［D］.吉林：吉林大学，2015.

［3］吴宣，等.小反刍兽疫诊断技术的研究进展［J］.四川畜牧兽医，2014，（6），30-32.

［4］杨翠玲.小反刍兽疫诊断技术及其疫苗研究进展［J］.饲料博览，2013，（2）：46-49.

［5］Sumption KJ，et al.Detection of peste des petits ruminants virus antigen in conjunctival smears of goats by indirect immunofluorescence［J］.Veterinary Record，1998，142（16）：421-424.

［6］曲林茂.表达小反刍兽疫病毒H，F蛋白的重组山羊痘病毒的构建及免疫原型研究［D］.南京：南京农业大学，2009.

［7］Choi K S，et al.Rapid competitive enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibodies to peste des petits ruminants virus［J］.Clinical and Diagnostic Laboratory，2005a，12（4）：542-547.

［8］Balamurugan V，et al.Development of indirect ELISA for the detection of antibodies against peste des petits ruminants'virus in small ruminants.Vet.res.Commun.2007，31（3）：355-364.

［9］何红菊.PPRV DAS-ELISA和胶体金免疫层析试纸条检测方法的建立［D］.昆明：昆明理工大学，2013.

［10］江馗语.小反刍兽疫诊断方法的研究进展［J］.现代畜牧兽医，2014，（5）：53-57.

［11］Saravanan P，et al.Development of a N gene-based PCR-ELISA for detection of Peste-des-petits-ruminants virus in clinical samples［J］.Acta Virol，2004，48（4）：249-255.

［12］蒋梅，等.小反刍兽疫荧光诊断技术研究［J］.黑龙江畜牧兽医，2012，（7）：102-105.

［13］李伟，等.快速检测小反刍兽疫病毒RT-LAMP方法的建立［J］.中国预防兽医学报，2009，31（5）：374-377.

［14］张家林.小反刍兽疫血清抗体免疫过氧化物酶单层试验检测方法的建立［D］.哈尔滨：中国农业科学院，2015.

［15］Berguido FJ，Bodjo SC，Loitsch A，et al.Specific detection of peste des petits ruminants virus antibodies in sheep and goat sera by the luciferase immunoprecipitation system［J］.J Virol Methods，2016，22（7），40-66.

10.3969/J.ISSN.1671-6027.2016.08.007

吴冉（1996～），河南省人，本科生，研究方向：传染病的发生和流行