范 玲 吴东方 刘殿雷⋆

急性结肠炎大鼠胃肠动力改变与ICC破坏有关研究

范 玲 吴东方 刘殿雷⋆

目的 在大鼠结肠炎模型基础上，初步探讨炎性肠病大鼠胃肠动力障碍的可能机制。方法 将40只SD大鼠随机分成对照组和急性结肠炎组。肠炎组采用乙酸灌肠法制备，造模第3天，两组均禁食24 h，次日经口灌入印度墨汁，麻醉后剖腹取出贲门至直肠末端快速测量墨汁在胃肠道的推进长度及胃肠道全长的长度，计算胃肠传输速率；用透射电镜观察远端结肠Cajal间质细胞（ICC）的超微结构变化；采用Weston Blot方法检测ICC膜上c-kit蛋白表达。结果 与对照组比较，肠炎组胃肠传输速度明显减慢（P＜0.05）；电镜下，对照组远段结肠肌层超微结构为ICC呈纺锤形，有巨大的卵圆形核及向外伸展的长突起，胞质内有丰富的线粒体、大量的内质网，ICC与肠神经元及平滑肌细胞之间紧密联系；而肠炎组远端结肠肌层中ICC体积增大，胞质内线粒体肿胀、部分线粒体空泡样变，溶酶体数目增多，出现次级溶酶体内质网扩张，ICC与神经细胞及平滑肌间连接松散；Westernblot分析结果显示，与对照组比较，肠炎组远端结肠ICC c-kit蛋白质的表达量显著降低（P＜0.05）。结论 炎性肠病可导致胃肠动力障碍，其机制与ICC的破坏有关。

结肠炎 Cajal间质细胞 c-kit 电子显微镜 大鼠

据报道，自1950年至1980年，一直将炎性肠病归为是西方国家的疾病。在北美和欧洲，其发病率处于较高水平［1］。但近年来，随着环境及饮食结构的改变，我国炎性肠病发病率逐年上升［2］，其中儿童炎性肠病的发病率明显升高，已严重影响患者生活质量，同时消耗了大量的医疗卫生资源。据有关研究发现，炎性肠病常有一个急性炎症反应的病理过程，其临床症状常伴随胃肠动力障碍，但炎性肠病所引起的胃肠动力障碍机制尚不明确。本实验旨在通过观察急性结肠炎大鼠胃肠传输速率及Cajal间质细胞（ICC）的变化，为进一步阐明急性结肠炎胃肠功能障碍的病理机制提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料 2个月月龄健康Sprague-Dawley大鼠40只，平均体重（200±20）g，雌雄随机，由温州医学院实验动物中心提供，SPF级环境饲养；兔抗大鼠c-kit多克隆抗体购自Santa Cruz公司。兔抗大鼠GAPDH多克隆抗体购自Santa Cruz公司。

1.2 方法 （1）急性结肠炎模型的建立与分组：40只2个月月龄健康Sprague-Dawley大鼠，随机分成空白对照组（对照组）（20只）和急性结肠炎组（肠炎组）（20只）。大鼠禁食24h后，用2%戊巴比妥钠（50mg/ kg，ip）经腹腔注射麻醉后，将聚乙烯导管经肛插入大鼠结肠内，插入深度约6～8cm，肠炎组注入50ml/L乙酸溶液0.5ml，对照组大鼠注入等量生理盐水，采用尾高头低位作用20s后用生理盐水冲洗3次。造模后第2天，肠炎组动物出现腹泻，大便稀糊。（2）胃肠传输速率的测定：两组大鼠于造模第3天禁食24h后，经口灌入印度墨汁0.5ml，于30min后用2%戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔注射麻醉。将两组已麻醉的大鼠再随机分为两小组，每小组各10只。将其中一小组肠炎组和对照组大鼠开胸经左心室升主动脉用生理盐水快速冲洗血液，用10%甲醛（含1%氯化钙）灌注固定后，剖腹取出胃肠道从贲门至直肠末段；将另外一小组肠炎组和对照组大鼠脱颈处死，剖腹取出同前胃肠道，快速测出墨汁在胃肠道的推进距离及胃肠道全长，计算墨汁推进长度占胃肠道全长的百分比，即胃肠传输速率［3］。（3）组织标本的制备：胃肠道传输速率测定完毕后，于距离回盲部约3～4cm处取长约5cm的相同部位结肠，已灌注固定的结肠组织经后固定、脱水、透明，包埋及切片备用于HE染色；未经灌注固定的新鲜结肠组织分成两部分，取其中小部分结肠组织，每块组织切成lmm3大小快速放入2.5%戊二醛固定液中于4℃固定保存备做电镜观察，其余部分组织放入-86℃超低温冰箱保存。（4）HE染色：已备切片经二甲苯脱蜡，酒精水化，苏木素着色，盐酸分化，氨水反蓝，伊红染色，酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片后于显微镜下观察并拍照。（5）电镜标本制备：已固定的结肠组织，经0.01 M PBS漂洗，1%锇酸后固定1h，0.01 M PBS再漂洗，酒精及丙酮梯度脱水，丙酮与包埋剂混合逐步包埋成块，用半超薄切片机及超薄切片机切片后，经3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色后在透射电子显微镜下观察，并拍照。（6）Western blot法检测c-kit的表达：取新鲜大鼠结肠组织，并用常规方法提取总蛋白，BCA方法定量蛋白浓度。每个标本上样约100μg蛋白于12%SDS-PAGE 凝胶，电压80V约30min，改电压为125V约持续1h。然后从凝胶中采用半干转膜法转移蛋白质至PVDF膜，用含5%无脂牛奶TBST封闭，滴加兔抗大鼠c-kit多克隆抗体4℃孵育过夜，HRP标记的羊抗兔IgG抗体孵育1h，用 ECL显色，X线胶片曝光。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况及结肠组织病理学表现 对照组大鼠大便正常，活动性好，皮毛光滑，生长良好；肠炎组大鼠均于造模第2天出现腹泻，无进攻性，明显懒动，皮毛毛糙。实验后动物第3天结肠组织病理学表现：对照组结肠黏膜上皮结构完整，腺体排列整齐，少量炎性细胞浸润（见图1）；肠炎组大鼠结肠可见黏膜及黏膜下层水肿充血，大量急性炎性细胞浸润，可见黏膜溃疡（见图2）。

图1 正常对照组结肠组织HE（×400）

图2 炎症组结肠组织HE（×400）

图3 对照组大鼠远端结肠电镜结构：上方平滑肌细胞（SMC），内见线粒体、密斑（白色↙所示）及排列整齐的肌丝，细胞间连接紧致；中间ICC内可见大的长椭圆形细胞核及大量线粒体（黑色粗→所示），下方肌间神经元（N），内见神经分泌颗粒（○所示）及线粒体，细胞间联系紧密

图4 肠炎组大鼠远端结肠电镜结构：上方ICC，内可见扩张的内质网（↖所示）、肿胀的线粒体（↗所示）及次级溶酶体（黑色○所示）；中间是神经元（N）；下方SMC，内可见肿胀的线粒体（白色○所示），细胞间联系不清

2.2 胃肠传输速率的测定 肠炎组胃肠平均传输速率为（48.2±5.2）%，对照组大鼠为（60.3±3.0）%，肠炎组大鼠胃肠传输速率较对照组明显延迟（P＜0.05）。

2.3 透射电子显微镜观察结果 大鼠远段结肠肌内及肌间ICC超微结构：（1）对照组大鼠结肠肌内及肌间ICC向外伸出长的突起，形状如纺锤形。细胞内可见巨大椭圆形或卵圆形核；胞浆丰富，内含大量粗、滑面内质网及线粒体，可见质膜穴样凹陷以及发达的高尔基体；肠神经元、ICC及平滑肌细胞之间可见连接紧致（见图3）。（2）肠炎组大鼠结肠肌内及肌间ICC电子密度降低，体积偏大，内可见嵴排列紊乱、断裂或消失，形态变圆肿胀的线粒体，部分线粒体见空泡样改变；溶酶体偏多，可见次级溶酶体；内质网扩张，可见空泡形成，质膜穴样凹陷结构不清，与周围神经元及平滑肌连接松散。与对照组比较，肠炎组中ICC少见，细胞结构难以辨清（见图4）。（3）Western blot法检测结果：用Western blot法检测大鼠远端结肠肌内c-kit 蛋白质表达量，以GAPDH作为内参照。经聚丙烯酰胺凝胶电泳及PVDF膜蛋白质印记后结果可显示一条分子量为145 KD蛋白质条带，与c-kit分子量大小相符，内参照蛋白条带GAPDH出现于36 KD。通过比对GAPDH与c-kit相对灰度值，而计算出c-kit蛋白表达倍数改变情况（Fold change），结果显示肠炎组大鼠远端结肠c-kit蛋白表达水平与对照组比较，其表达明显下降（P＜0.05）。

3 讨论

随着逐年攀升的胃肠道炎症性疾病发病率，胃肠道炎症引起的运动障碍机制已成为关注焦点，当前许多学者认为胃肠动力障碍与胃肠道的肠神经系统、植物神经系统、胃肠激素、ICC及自身免疫等因素密切相关。本实验主要以SD大鼠远端结肠为观察对象，通过建立大鼠结肠炎模型，观察其远端结肠组织内ICC改变与胃肠运动的关系初步探讨胃肠运动障碍的机理。

胃肠道广泛分布着ICC，其在维持胃肠道正常的生理功能中发挥重要作用，是胃肠道慢波起搏细胞。现已有研究表明多种胃肠动力疾病的发生与ICC变化密切有关，ICC超微结构、细胞数目及其生理功能改变可能是导致许多胃肠动力障碍疾病的病理生理学基础［4-5］。近年研究发现ICC位于神经终末和平滑肌细胞之间［6-7］，并发现ICC与肠神经及比邻肌细胞之间形成特殊的“神经-ICC-平滑肌”功能单位［8］。Ramany认为ICC是自主神经纤维与平滑肌传递信号的中间介导体，自主神经可通过ICC对慢波电位活动的影响而建立胃肠平滑肌的收缩节律［9-10］。部分研究表明，肠道炎症反应可导致周围神经组织及平滑肌细胞结构损伤，ICC超微结构改变、数目减少，其与平滑肌细胞失去正常联系，功能上表现为ICC电活动异常及神经传递障碍导致肠道异常蠕动［11-12］。本实验通过电镜研究观察到：对照组大鼠远段结肠肌内及肌间ICC呈纺锤形，胞浆内含丰富粗、滑面内质网、线粒体及发达的高尔基体和质膜穴样凹陷，细胞向外伸出长突起；ICC与平滑肌细胞及肠神经元之间紧密联系。炎症组ICC体积偏大，线粒体嵴断裂或消失，肿胀甚至空泡样变；溶酶体数目偏多，可见次级溶酶体；内质网扩张，胞质内有空泡形成，质膜穴样凹陷结构不清；ICC与平滑肌细胞及神经细胞间连接松散。比较而言，肠炎组中ICC较对照组中数目减少，细胞结构不清，难以辨认，典型的“神经-ICC-平滑肌”功能单位破坏。这些超微结构的改变提示其可能导致胃肠运动障碍。

c-kit蛋白属跨膜蛋白，是细胞膜上一种酪氨酸激酶蛋白，其受体表达于所有ICC。主要通过c-kit受体ICC接受胞外多种刺激信号。多项研究发现c-kit与干细胞因子（stem cell factor，SCF）构成SCF/c-kit信号系统，当编码kit和或SCF的基因发生突变，SCF/c-kit信号途径受损，会导致胃肠道部分ICC亚群增殖、分化和发育障碍［13-15］，临床常表现为反流性食道炎、胃潴留、十二指肠内容物逆流等胃肠功能障碍症状。本实验采用western blot 法检测急性结肠炎模型SD大鼠远端结肠c-kit蛋白表达情况，结果显示为相较于正常对照组肠炎组c-kit蛋白的表达量明显下降，结合电镜观察结果显示ICC数目减少，提示c-kit蛋白表达下降可能影响ICC细胞的分化、发育，甚至增殖，从而导致胃肠动力障碍。

本实验通过对大鼠结肠急性炎症的研究，表明炎性肠病可导致胃肠动力障碍即胃肠传输速率下降，其机制与ICC的破坏有关，具体机制尚需进一步基础研究。

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Objective To preliminarily study the possible mechanism of disorder intestina1 motility of acute colitis based on the model of SD rats with acute colitis. Methods 40 rats were randomly divided into control group and acute colitis group．The model of acute colitis rats was built by clyster with acetic acid. Three days later，both groups of rats were were fasted for 24 hours，and the next day 0.5 mL India ink were poured into orally. 30 min later，the rats were anesthetized，then we cut into the abdomen to get the whole digestive tube from cardia to the terminal rectum and quickly measured the ink promoting length in the gastrointestinal tract and the length of the whole gastrointestinal tract to calculate their ratio to get the rate of gastrointestinal transit. Electron microscopy was used to observe the ultrastructural changes of interstitial cells of Cajal （ICC） . Western blot analysis was used to detect the expression of c-kit protein on the membranes of ICC. Results Compared to rats in control group，the rate of gastrointestinal transit in rats with acute colitis signifcantly decreased（P＜0.05）. Under electron microscope，ultrastructure of interstitial cells of Cajal in muscle of distal colon of control rats was like the spindle，containing a huge oval nucleus and long processes stretching out，and the cytoplasm is rich in mitochondria，a large number of endoplasmic reticulum. Cell links was close among ICC，intestinal neurons and smooth muscle cells. While in acute colitis group，the volume of ICC in the distal colon muscle layer increased，swollen mitochondria in the cytoplasm，some mitochondria vacuolar degeneration，increased numbers of lysosomes and endoplasmic reticulum expansion in secondary lysosomes. The loose cell link among ICC，intestinal neurons and smooth muscle cells was observed. Western blot analysis revealed thatbut c-kit protein expression in ICC in distal colon tissues in acute colitis group was signifcantly reduced compared to control group（P＜0.05）.Conclusions Infammatory bowel disease can lead to gastrointestinal motility disorder. The mechanism involved is related to the destruction of ICC.

Acute colitis Interstitial cells of Cajal C-kit Electron microscopy Rats

浙江省中医药管理局优秀青年基金项目（2013ZQ026）；杭州市科技发展计划项目（20140733Q34）

310007 杭州钢铁集体公司职工医院儿科（范玲）

325000 温州医学院组胚教研室（吴东方）

310007 杭州市中医院外一科（刘殿雷）

*通信作者