陈伟娜王燕清陈嘉璐

1.遵义医学院第五附属 （珠海）医院，广东珠海 519100；2.丽珠医药集团股份有限公司研究院，广东珠海 519090

替加环素微生物限度方法学验证研究

陈伟娜1王燕清2▲陈嘉璐2

1.遵义医学院第五附属 （珠海）医院，广东珠海 519100；2.丽珠医药集团股份有限公司研究院，广东珠海 519090

目的建立替加环素的微生物限度验证方法。方法取本品5g，加入100mL营养肉汤，均匀分散，500r/min离心3min，取上清，为1∶20供试液。分别取供试液1mL，按薄膜过滤法分别处理，用含0.3%吐温80的0.1%灭菌蛋白胨水溶液冲洗滤膜，冲洗量600mL，以消除替加环素样品的抑菌活性，进行替加环素的细菌及真菌的微生物限度验证。结果采用上述方法进行验证，5种菌的回收率均达到70%以上。结论采用薄膜过滤法，用600mL含0.3%吐温80的0.1%灭菌蛋白胨水溶液冲洗滤膜的方法可用于替加环素微生物限度的检查。

替加环素；微生物限度；方法学验证；吐温80

替加环素由惠氏（Wyeth）公司研发，美国FDA于2005年6月和2006年7月批准惠氏的替加环素（Tigecycline，商品名Tygacil注射用替加环素）为治疗复杂腹腔内感染和复杂皮肤感染的一线药物[1]，其化学结构式见图1。该品种是甘氨酰四环素类抗生素中获得批准的第一个产品。替加环素对G+菌、G-菌、厌氧菌有广谱抗菌活性[2-4]，包括多重耐药性的G+菌，如MRSA、MRSE、抗青霉素的肺炎链球菌、VRE[5-6]。对不同耐药机制的耐四环素致病菌同样有效[7-9]，但对铜绿假单胞菌无抗菌活性[10]。替加环素是新型甘胺酰环素类抗生素，主要与细菌核糖体30S亚基结合，阻碍氨基酸肽延长，从而抑制细菌蛋白质合成来发挥抗菌活性[11]。他克服或限制了很多抗菌药物产生的两种主要耐药机制:外排泵和核糖体保护[12]。避免了四环素类抗生素耐药机制对其产生作用。

因为替加环素的抑制细菌能力很强，所以我们在微生物限度方法学验证中，采用了直接接种法及培养基稀释法及不加吐温的薄膜过滤法等常规方法，细菌的回收率均无法达到要求。为消除本品的抑菌活性，我们发现当冲洗液中加入一定量的吐温后，即可满足细菌回收率的要求，我们通过对吐温含量和冲洗量的考察，最终确定本品的微生物限度方法，即采用薄膜过滤法，取1ml的供试品溶液，用600mL pH7.0含0.3%吐温80的0.1%无菌蛋白胨溶液作为冲洗液。具体研究如下。

图1 替加环素结构式

表1 不同吐温浓度的影响

1 材料

1.1 实验器材

YB-DX23D型电动吸引器[上海医疗器械工业（集团）公司医用吸引器厂]，800型离心机（上海手术器械厂），过滤器（浙江宁海县城关白石医药仪器厂）。

1.2 样品

替加环素，由丽珠医药集团研究所提供。

1.3 培养基及冲洗液

培养基：胰酪大豆胨培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基均购自广东环凯微生物有限公司。培养基适用性符合《中国药典》2015版，四部(通则1105)规定[13]。冲洗液：pH 7.0含0.3%吐温80的0.1%蛋白胨水溶液。

1.4 试验用菌种

金 黄 色 葡 萄 球 菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26003]；铜 绿 假 单 胞 菌(pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10104]；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501]；白 色 念 珠 菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]；黑曲霉(Aspergillus niger) [CMCC(F)98003]。菌种均来自中国食品药品检定研究院医学菌种保藏中心。

2 方法与结果

参照2015版《中国药典》方法及注射用替加环素进口注册标准。

2.1 菌液制备

参照2015版《中国药典》四部(通则1105)规定的检查法操作，取30～35℃培养24h的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌,20至25℃培养3d的白色念珠菌的新鲜培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液制成50～100CFU/mL的菌悬液，备用。取20～25℃培养6d黑曲霉的新鲜培养物加入0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液4mL洗下孢子，吸出转移至空试管作为原液，用含有0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液稀释，得到50～100CFU/mL的孢子悬液，备用。

2.2 供试品溶液的制备

因原料成本较高而且抑菌活性较强，因此在制备供试液时选择1∶20供试液而不选用1∶10的，具体操作如下：取本品5g，加入100mL营养肉汤，均匀分散，500r/min离心3min，取上清，为1∶20供试液。

2.3 试验步骤

因为替加环素对真菌没有抑菌活性，所以在方法学摸索的过程中只选取细菌进行验证，待方法确定后，再进行5种菌的验证，具体步骤如下：（1）吐温浓度的选择 在参考替加环素原料厂家提供的微生物限度检测方法的基础上，我们考察了冲洗液中加入不同浓度吐温80的细菌回收率情况，分别考察了3.0%（原料厂家提供的浓度）、1.0%、0.5%、0.3%及0.1%五种浓度，冲洗量均为800mL的回收率情况，见表1。

结果显示，当吐温的浓度达到0.3%以上时，三种菌的回收率均可达到70%以上。由于在配制溶液，当吐温的浓度越大，吐温越难溶解，而且，在过滤过程中会产生大量的气泡从而影响试验操作，因此选定0.3%的吐温浓度。

表2 不同冲洗量的影响

表3 细菌、霉菌及酵母菌回收率菌落计数

冲洗量的确定 为了确定冲洗液的冲洗量，本试验用含0.3%吐温80的冲洗液，选择了800mL、600mL、500mL及400mL的四种冲洗体积，以确定微生物限度验证的冲洗量，见表2。

从试验结果可知，当冲洗液的冲洗体积在500mL以上时即可满足回收率的要求，为了确保试验结果，我们确定选用600mL的冲洗液进行冲洗。

验证方法学的确定 从以上试验结果可知，选用600mL的pH 7.0含0.3%吐温80的0.1%蛋白胨水溶液作为冲洗液可保证各种菌的回收率均达到70%以上，为了验证该方法，我们用以上确定的方法，进行细菌、真菌的验证，共进行3次独立的平行试验：试验方法，试验组用少量稀释液先将孔径为0.45μm的薄膜过滤器润湿，取供试液1mL，加至50mL的稀释液中，直接通过过滤器，用稀释液冲洗滤膜，每次100mL，共冲洗6次，在最后一次冲洗液剩余约15mL时加入50～100cfu/mL验证菌株，取出滤膜，菌面朝上贴于已凝固的胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上。每种菌株制备两个平皿。菌液对照组：用少量稀释液先将孔径为0.45μm的薄膜过滤器润湿，用稀释液50mL冲洗滤膜，在冲洗液剩余约15mL时加入50～100cfu/mL验证菌株，取出滤膜，菌面朝上贴于已凝固的胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上。每种菌株制备两个平皿。供试液对照组：用少量稀释液先将孔径为0.45μm的薄膜过滤器润湿，取供试液1mL，加至50mL的稀释液中，直接通过过滤器，冲洗、培养方法同试验组。稀释剂对照组取营养肉汤稀释液替代供试品，冲洗、培养方法同试验组。培养 将细菌平皿倒置于30～35℃下培养48h，霉菌平皿倒置于23～28℃下培养72h。观察和计数：对每个平皿逐日检查计数，结果以培养终了时的计数为准，并将每组试验中接有相同试验菌株的平皿计数进行平均，取平均值，见表3。观察微生物的菌落形态并做革兰氏染色，以确认生长菌与接入的微生物相同。

由实验结果可知，利用该方法，五种菌的回收率均达到70%以上，因此确定该验证方法可行。

3 讨论

因为替加环素对G+菌、G-菌、厌氧菌有广谱抗菌活性， 包括多重耐药性的G+菌，如MRSA、MRSE、抗青霉素的肺炎链球菌、VRE，所以不能使用常规方法进行微生物限度验证。替加环素原料厂家已提供有微生物限度验证方法，其采用培养基稀释法，采用的是0.3%大豆卵磷脂3%吐温80胰蛋白大豆琼脂培养基。但其存在一定的问题，我们按其提供的方法进行方法学研究时发现，因其培养基显白色，所以菌落无法计数，从而无法进行微生物限度验证。

当药品本身具有抗菌活性时，应当首先消除其抗菌活性，才能保证检验结果的真实性和有效性[14]。对于一些抑菌活性较强的抗生素，要消除其抑菌活性，可在冲洗液中加入一定浓度的吐温80[15-16]。原料厂家提供的方法中采用的冲洗液中含有3.0%的吐温80，过滤过程中会产生大量的气泡而影响试验操作。我们通过对冲洗液中吐温80的浓度进行摸索，发现当吐温80的浓度达到0.3%以上时，实验菌的回收率均可达到70%以上，所以我们将冲洗液中吐温80的浓度从3.0%降低为0.3%，从而避免了过滤过程中会产生大量的气泡而影响试验操作。

冲洗液的用量对于很多抑菌活性强的药品的微生物限度验证至关重要，太少了无法消除抑菌活性，太多了有可能会致使滤膜破裂。我们通过对不同冲洗液体积的研究，确定使用600mL含0.3%吐温80的冲洗液即可消除替加环素的抑菌活性，达到微生物验证的目的。

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Research of microbial limit methodology validation of tigecycline

CHEN Weina1WANG Yanqing2CHEN Jialu2
1.The Fifth Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Zhuhai 519100,China;2.The Institute of Livzon Pharmaceutical Group Inc.,Zhuhai 519020,China

ObjectiveTo establish a method for microbial limit test on tigecycline.MethodsThe sample (5g) was dispersed uniformly to the nutrient broth medium (100mL),which was centrifuged for 3 minutes at 500r/min.The supernatant was diluted with the ratio of 1:20 as the test solution,and the filter membranes were incubated with the test solution (1mL) respectively,which was rinsed by the sterile solution(600mL) containing 0.3% tween-80 and 0.1% peptone,with the aim of eliminating the interference of tigecycline's bacteriostatic activity,to verify the method of Tigecycline's microbial limit test.ResultsWith the method above,the recoveries of all the five validated bacteria were over 70%.ConclusionThe membrane filtration method,which is that the membrane-filter is rinsed by the sterile solution (600mL) containing 0.3% tween-80 and 0.1% peptone,and it can be applied for the test of Tigecycline’s microbial limit.

Tigecycline;Microbial limit test;Methodology validation;Tween-80

R446.5

B

2095-0616（2016）21-67-04

2016-09-07）

广东省珠海市高新技术领域科技攻关及高新技术产业化项目（2012D0201990040）。

▲通讯作者