色谱分析中的样品前处理

制约分析效率和准确度提升的关键环节

色谱分析常常用于各种复杂的基体以及低含量组分的测定，消除基体干扰、提高分析灵敏度、延长仪器寿命一直以来都是需要解决的普遍性问题，因此，样品进行色谱分析前的前处理变得非常重要。

使用色谱对复杂基体进行分析时，样品前处理步骤往往繁琐耗时、易引起误差,但在发展分析方法的同时，人们或多或少忽视了样品的预处理问题。如果前处理不当，往往会使全过程的回收率降低，会导致定性定量错误和色谱柱寿命缩短等问题。因此，提高和掌握样品的前处理技术是完善检测全过程的重要环节。迄今为止，样品前处理的方法很多，本质上可分为两大类：一类是对检测器响应弱(或无信号)的样品，通过衍生技术改变其物理和化学性质，使之成为可被检测的化合物；另一类是通过对复杂基体样品中低含量组分进行分离、纯化和富集以获得同样效果。

样品前处理的意义

1.去除基体中干扰样品分析的杂质，提高分析精度和分离效果；2．提高被测定化合物检测灵敏度；3．提高样品与流动相的兼容性，从而改善定性定量分析的重复性；4.增加选择性；5.减少停机概率。

样品前处理的要求

过程简单，处理速度快速，使用装置要小，引进误差要小，对目标物有高选择性有较高回收率，且绿色环保。

图1.溶剂萃取中的索氏提取器。

常用样品前处理技术

溶剂萃取、固相萃取、超临界萃取、衍生化、膜分离、蒸馏、吸附。

常规萃取

两种模式：1.液液萃取：分流漏斗；2.液气萃取（溶液吸收）：对气态、样品蒸汽及气溶胶等中的样品进行吸附。

蒸馏

分类：水蒸汽蒸馏、减压蒸馏、分馏。

应用：草药中植物油、奶产品中有机体氯污染物、环境样品中挥发性有机物。

关于固相萃取

1.步骤：活化吸附剂→反相萃取柱用水溶性有机溶剂→正相萃取柱用目标化合物溶剂。

2.分类

正相：萃取极性化合物；

反相：萃取中等极性到非极性化合物；

离子交换萃取：吸附带有电荷的化合物；

3.萃取柱的选择

尽量选择与目标化合物极性相似的吸附剂；样品溶剂的强度相对该吸附剂应该较弱。

4.上样

通过抽真空、加压或离心的方法使样品进入吸附剂。

5.洗涤和洗脱

先用弱溶剂洗干扰物，再用较强的溶剂洗目标化合物；也有的将干扰物吸附在柱上而目标物直接流出进行收集。

6.固相萃取主要应用

复杂样品中微量或痕量化合物的分离和富集。如：生物体液，中药及其代谢产物，食品有效成分或有害成分分析，环保水样中各种污染物的分析。

固相微萃取（SPE）

优点：操作时间短、样品量小、无需萃取溶剂、适用于挥发及非挥发性物质、重现性好。

关键：萃取头涂层选择，其原则是极性涂层适合于极性化合物，非极性涂层适合于非极性化合物。

气体萃取（顶空技术）

分类：静态顶空和动态顶空；

优点：操作简单、可自动化、可变条件多、灵敏度高；

衍生化技术优点：能够将一些物质通过衍生转化为可进入色谱测定的物质；提高检测灵敏度；改变化合物色谱性能，改善分离度；可以帮助进行化合结构的鉴定。

衍生化技术

柱前衍生应满足的条件：

1）反应能迅速、定量的进行，反应重复性好，反应条件不苛刻，易操作；

2）反应的选择性高，最好只与目标化合物反应，即反应的专一性；

3）衍生化反应产物只有一种，反应副产物和过量的衍生化试剂应不干扰目标化合物的分离与检测；

4）衍生化试剂应方便易得，通用性好。

气相色谱中常用的衍生方法

1.硅烷化衍生方法

该方法是气相色谱样品中应用最多的方法，它是利用含有活性氢的化合物（如醇、酚、酸、胺、硫醇等）与硅烷化试剂反应，形成硅烷衍生物：

R3Si-X+H-R’→R3Si-R’+ HX

能进行硅烷化的化合物反应活性一般为：醇〉酚〉羧酸〉胺〉酰胺，反应活性还受空间位阻的影响，其醇的反应活性为伯醇〉仲醇〉叔醇，胺的反应活性为：伯胺〉仲胺。

2. 酯化衍生方法

一般该法用于将热稳定差，挥发弱的有机酸转化为酯。

1）三氟化硼催化

RCOOH+CH3OH=RCOOCH3+H2O

2）重氮甲烷法

RCOOH + CH2N2= RCOOCH3+ N2（非水介质完成）

3）三氟乙酸酐法

RCOOH+R’OH=RCOOR’+H2O

本法适合于空间位阻较大，有机酸、醇或酚的酯化。

3.酰化衍生方法

该法能降低羟基、氨基、巯基的极性，改善它们的色谱拖尾，并能提高这些化合物的挥发性，且能增加某些易氧化化合物（儿茶酚胺）的稳定性。

ROH(-NH2，SH)+ R’COX = ROCOR’ + HX

衍生化应注意的问题

1）衍生化完成后，应用干燥氮气吹走挥发性溶剂。

2）在使用一些对水敏感的衍生化试剂时，一定要对样品和使用的溶剂进行脱水，并在反应过程中避免水汽干扰。

3）所用反应容器特别是密封垫片的材料绝对不含目标化合物。

4）当生成的衍生产物是易挥发化合物时，应采用密封的衍生化容器或低温冷冻装置。

5）衍生化完成后应及时进行色谱分析。

中药样品中的前处理技术

1.常压蒸馏技术

样品前处理：将样品直接切碎，常压水蒸汽蒸馏，无水乙醚萃取，旋转挥发除去乙醚，用无水硫酸钠除去水分。

色谱条件：非极性柱，小于10℃/ min升温至250℃，进样口温度：250℃。

2.微波萃取技术

优点：常温强化萃取，不破坏中药材中某些具有热不稳定、易水解或氧化特征的药效成分；时间短，一般10～30 min即可获得最佳提取率；适用性广，绝大多数的中药样品均可超声萃取；与溶剂和目标物的性质（极性）关系不大。

样品前处理：样品粉碎、蒸馏水浸泡、微波加热、水蒸汽蒸馏法提取、经无水硫酸钠干燥后检测。

色谱条件：弱极性柱，小于10 ℃/ min升温速率，终止温度250℃。

3.超临界液体萃取技术（SFE）

优势：传质速度快、渗透能力强、溶解萃取效率高、可在室温提取热敏性成分、绿色环保。

适用范围：挥发油、小分子萜类、部分生物碱；通过添加夹带剂如甲醇、丙酮等增加压力，可改善流体性质，对中药生物碱、黄酮类、皂甙类等非挥发性有效成分的提取也日趋普遍。

4.固相微萃取技术（SPE）

优点：无需有机溶剂，操作简便；易于自动操作；有很好的方法准确度和重现性。

类型：直接萃取法：萃取纤维直接暴露在样品中，适用于分析气体样品；顶空萃取法：纤维暴露于样品顶空中，适用于固体样品中的挥发性以及半挥发性样品。

原理：利用残留农药与样品基质的物理化学特性差异，使其从样品基质中分离出来。

理化特征：化合物极性和挥发性，其应用分别为：极性主要与化合物溶解性及两相分配有关，如液液提取，固液提取及液固提取；挥发性主要与化合物气相分布有关。

提取剂选择原则：农药的极性和水溶性，即相似相溶原理。

农药极性的大致判断：分子的极性与分子中的π电子及孤对电子相关。

注意：极性和分子大小是农药和其它有机化合物水溶性的基础。如对氧磷溶解度3640 mg/L，而对硫磷只有12.4 mg/L。

农残分析中的样品前处理

1.液液提取

液液提取溶剂选择：选用非极性或弱极性溶剂（如已烷），中等极性农药可选二氯甲烷。提取原则：少量多次（一般三到五次）。

2.固液提取

溶剂选择：含水量大的样品选用与水混溶的溶剂或混合溶剂；含脂肪多的样品则用非极性或极性弱的溶剂；土壤样品则用含水溶剂或混合溶剂。

常用方法：索氏提取法、振荡提取法、组织捣碎法、消化提取法。

3.固相提取法（SPE）

萃取小柱类型：正相吸附剂：硅胶、弗罗里硅土、中性氧化铝等。

4.固相萃取法

水样残留农药一般是先将农药保留在柱子上，再用溶剂洗脱；而食品、动植物样品残留农药一般是让杂质保留在柱子上而农药通过；对含水量高的果蔬样品，用水混溶性溶剂提取后，将提取液通过反相柱可把油脂、蜡质等非极性杂质留在柱上而去除。

在农残分析样品的提取净化上，一般都是先用反相柱处理，所用的洗脱剂就是水混溶的溶剂或单独用水，使亲脂的杂质吸附在柱上，而农药流过柱子。

5.顶空法

吹扫捕集主要用于水样中挥发性有机物分析。静态顶空法适用于水样以及其它液态样品和固态样品分析。

主要应用范围：EPA使用静态顶空/GC测废水和PVC中的氯乙烯；FDA应用静态顶空/GC法测定植物油、合成食品、醋等样品中的氯乙烯；美国药典规定用静态顶空/GC方法测药品中挥发性有机杂质。

不同形态样品的提取方法

1.水样

对非极性残留，用非极性溶剂直接萃取；对弱极性的残留，可以按如下步骤：

1）增加提取剂的量；

2）选用极性稍强溶剂如乙酸乙酯；

3）在水中加入氯化钠，使其盐析出来；

4）调整溶液PH：如分析物是酸性的，调PH至3左右；如分析物是胺，用氨水调PH至10左右。

2.植物和动物样品

一般采用溶剂提取法，如振荡法、组织捣碎法。提取溶剂一般可用水溶性的乙腈、丙酮、甲醇等，可以减少脂类物质。

3.土壤样品

用水将样品湿润（含水量约5%），然后用强极性溶剂或混合溶剂进行提取，较多使用振荡法、索氏提取法。百草枯及其联吡啶除草剂提取时用强酸消化处理。 LP

本文资料由《实验与分析》编辑整理。