文/ Koen Sandra

自动化的液体分馏

文/ Koen Sandra

利用SPE实现液体分馏的自动化

在对新陈代谢学的研究中，常常要面对大量检测样本，以便能从样本集中找出统计学差异。现如今，样本制备的自动化给我们带来了很多惊喜，也许能够帮助您降低检测波动的幅度。

新陈代谢学的典型研究过程中，包含了大量的不同工作步骤，例如提取、分馏或纯化、衍生化、分析物的浓缩，尤其是生物样本分子（MG＜2000）的浓缩，例如微生物、植物、动物和人类分子样本的浓缩。这些工作步骤需要采用气体或液体色谱分离系统（GC/LC）和质谱分析技术（MS）联用。为了能够区分所采集样本的类型就需要相对较大的样本集，在进行样本的检测分析时最重要的就是分析波动范围应尽可能小，小于自然状态下生物变异的差异。现如今，样本制备过程的自动化能够帮助您提高检测分析方法的重复精度。就超声波支持的液体自动萃取和Gestel公司研发生产的MPS型多功能样本前处理工作站的过滤问题本文暂不讨论。本文主要介绍基于SPE的自动化分馏工艺，一种在脂类组学研究框架内使用的分馏工艺技术。

在所考察的脂类组学中，所研究的是植物材料的特性以及它们所含有的类脂质，包括中性脂（NL）、游离脂肪酸（FF）和极性脂（PL）。同样令人感兴趣的是其组成成分之间基本的定量比例关系。上述的植物材料中，同类化合物中有着明显的浓度差异。在前面所述的检测试验中，不同脂类在前期LC/MC过程中的分馏和浓缩富集对最终结果的判定发挥了积极的作用。

首先，在所谓的福尔奇方法（Folch法）通过液-液萃取（FFE）装置获取浓缩的脂类组萃取物。这一步在使用氨丙基色谱柱（NH2）获得固相萃取物（SPE）后结束；在这一检测分析步骤中，我们获得了三种不同的极性脂质分馏物。所有的萃取物自动富集到合适的浓度，并利用LC-QTOF四极杆飞行时间液质联用技术进行分析。

图1.按照SPE固相萃取分馏技术和MVAP多点蒸发浓缩重组植物萃取液（A、B、C为三种不同的植物种类）。

多功能样本前处理工作站

上面介绍的所有操作步骤都是在MPS型多功能样本前处理工作站以及在计算机的支持下全自动完成。我们都知道，实验中，很容易因为更换所需工具而延误时间，或者因实验室工作人员没有注意到一些细节而影响试验进度。本文介绍的系统中，MPS工作站有两根可以在三维方向上运动的机械臂，这一工作站可以配用不同规格型号的注射器，以及有目的地处理不同液体和不同容积的样本。

工作站的这一套装备配置再加上一些相关的技术功能，可大大扩展工作站的用途，使其更高效地完成检测分析任务。MPS多功能样本前处理工作站还有一个特殊的专用模块MVAP多点蒸发站，它能自动将萃取物在真空环境下干燥，从而保证了在其恢复时仍能保持较小的的溶剂体积。

脂类的提取是按照下述方式进行的：1 g的植物材料置入氯仿和甲醇（2：1）的混合液中进行萃取。在溶液定量中加入4 ml水，取出1.5 ml的氯仿过滤、灌入小瓶中，然后在MVAP多点蒸发站中蒸发溶液的水分。将萃取物放入300 µl氯仿中，在NH2相中调出SPE固相萃取物、以便在LC/MS分析中测定出其所含有的类脂质。

加入由氯仿和异丙醇按2∶1的比例混合而成的3 ml溶液，从NH2相中洗脱出中性脂NL。在分馏游离脂肪酸（FF）时使用的是含有2%乙酸的二乙醚溶液；而极性脂质的萃取使用了3 ml的甲醇。若不同脂类组萃取物的所有SPE固相萃取都是手动进行的，则整个萃取工作需要耗费很长时间才能完成。但如果是在全自动化系统下进行，就能够大大提高检测效率。据悉，它允许无人值守的工作过程，包括在夜间和周末的时间里自动完成。

表1.脂类组学检测分析方法的精度，包括自动化样本制备的步骤

三组分馏物汇总放入10 ml的安瓿瓶中，在MVAP工作站中进行干燥。残留物的清理和随后的液相色谱/质谱分析是在氯仿和异丙醇的溶液中进行的。所需的溶液量多少根据脂类的浓度在萃取过程中进行优化。

在萃取分析时使用的是Agilent 1290 UHPLC系统与6540 QTOF相连接的检测系统。LC分离系统流动相为含有20 mM甲酸铵的甲醇水溶液，色谱柱为反相柱C18。整个检测流程采用了液相色谱/质谱分析方法，分别设置多种不同的溶剂梯度和质谱条件进行分析，方法之间的不同点为：第一种方法是利用ESI POS电喷雾离子化测定阳离子；第二种是ESI NEG电喷雾负离子法；第三种则是ESI POS和ESI NEG两种方法的组合。

成功地利用自动化

在一项植物脂类组学研究中利用上述自动化检测分析方法对共计84份样本进行了检测分析。样本组由三大类共计22种不同的植物样本组成，每一份都一式三份的进行了样本制备和检验分析。另外还分析了18个QC质量控制样本，以便对样本制备以及LC/MS的重复精度进行评估。

检测的项目为：A检测记录曲线显示的是单甘酯（MGS）、甘油二酯（DGs）、甘油三酯（TGS）和植物固醇；B检测记录曲线显示的是在ESI-NEG电喷雾负离子法检测中，分馏2中存在的LCFAs长链游离脂肪酸；C和D检测记录曲线表示的是在ESI-POS电喷雾离子化和ESI-NEG电喷雾负离子检测方法中检测到的磷脂Pls、鞘脂和其他极性脂质（参见图2）。

图2.不同SPE固相萃取在LC-QTOF四极杆飞行时间液质联用技术检测中得到的离子色谱总图。

图3.Gestel研 发生产的双机械臂MPS型多功能样本前处理平台,用于自动化固相萃取SPE和样本萃取物浓缩。

为了能够评估检测的分析精度，选了一系列经过鉴定的化合物作为对照组，并计算出峰面积的标准偏差（RSD%）。在脂类组学研究中，用于面积相对偏差值的测试值（Cut-off临界值）一般为30%。值得注意的是，在对照组检查的18个QC质量控制样本中，所有分析物的面积相对偏差都小于25%，其中半数甚至小于12%。

自动化样本制备的实现

Gestel公司MPS型多功能样本前处理平台，非常适用于代谢组学领域的开发以及研究，因其能够保证实现样本制备的自动化。正如上文中植物类脂质的检测过程一样，一种基于SPE固相萃取的脂质分馏技术在专用的参数配置下实现了完全自动化，包括利用溶剂挥发使SPE固相萃取分馏物浓缩。分馏物的LC/QTOF分析表明了检测结果有非常好的重复性。 LP

脂类组学

脂类组学所研究的对象是细胞或者有机体中基本不溶于水（疏水性）的天然物质，也就是脂质，它们是细胞膜的主要组成部分。与侧重于所有蛋白质总和的蛋白质组学研究相比较，脂类组学采用分析技术方法来检测脂质总体中的生物体并确定它们的功能。在这一背景下，质谱技术被认为是最合适的检测方法了。脂类组学的目的是：了解脂质在代谢紊乱疾病中起着什么样的作用，例如在如肥胖症、动脉粥样硬化、中风、高血压或糖尿病中的作用。

图3.Gerstel公司基于MPS技术的DBS自动进样器（左）和SPExos模块（右）与LCMS-MS（图中未出现）直接耦合。

Lerch博士表示，在采集样本质量为16 µg时，从质谱柱中出来的分析物的绝对质量有4～120 pg，适合于最小的校验仪使用。总而言之，它为法医毒理学的检测分析提供了足够的线性检测范围，其标准偏差的平均值只有8%。据应用技术专家介绍，目前MPS-DBSSPExos-LC/M系统，正在越来越多的被应用于兴奋剂检测领域中。 LP

本文作者来自Kortrijk市色谱技术研究所。